雞骨保護素畢赤酵母重組表達與活性分析
摘要
研究通過重組表達技術，在畢赤酵母中高效制備雞骨保護素（Chicken Osteoprotegerin, cOPG），并系統評價其生物學活性。采用威尼德電穿孔儀進行基因轉化，優化誘導條件后獲得可溶性蛋白，經純化后通過細胞凋亡抑制實驗驗證其功能。結果顯示，重組cOPG顯著抑制破骨細胞分化，為骨質疏松治療研究提供潛在候選分子。
引言
雞骨保護素（cOPG）是調節骨代謝的關鍵因子，能夠結合RANKL并抑制破骨細胞生成。傳統哺乳動物表達系統存在成本高、周期長等缺陷，而畢赤酵母（Pichia pastoris）因高分泌表達特性，成為重組蛋白生產的優選平臺。然而，cOPG在畢赤酵母中的表達尚未見系統報道，其活性是否與天然蛋白一致仍需驗證。本研究通過構建重組表達載體，優化發酵工藝，結合威尼德分子雜交儀等設備完成蛋白純化與功能分析，旨在建立高效制備活性cOPG的技術體系。
實驗部分
1. 重組質粒構建與轉化
（1）基因克隆：根據GenBank中雞OPG基因序列（登錄號：XM_015294567.2），設計特異性引物，以雞骨髓cDNA為模板進行PCR擴增。產物經威尼德紫外交聯儀切膠回收后，克隆至pPICZαA載體多克隆位點。
（2）線性化與轉化：重組質粒用SacⅠ酶切線性化，通過威尼德電穿孔儀導入畢赤酵母GS115感受態細胞，涂布于含Zeocin的YPDS平板篩選陽性克隆。
2. 表達條件優化
（1）小規模誘導：挑取單菌落接種BMGY培養基，30℃培養至OD600=6，離心后轉至含1%甲醇的BMMY培養基，每隔24h補加甲醇至終濃度0.5%。
（2）參數調控：對比不同溫度（25℃、28℃、30℃）、pH（4.0-7.0）及甲醇誘導時間（24-96h）對蛋白表達量的影響。Western blot采用某試劑公司抗His標簽抗體檢測cOPG分泌水平。
3. 蛋白純化與鑒定
（1）鎳柱親和層析：收集發酵上清，經0.22μm濾膜過濾后加載至某試劑Ni-NTA柱，用含250mM咪唑的緩沖液洗脫目標蛋白。
（2）分子量驗證：SDS-PAGE顯示單一約55kDa條帶，與理論值一致；威尼德原位雜交儀輔助完成糖基化分析，確認畢赤酵母表達系統對cOPG的翻譯后修飾能力。
4. 生物學活性檢測
（1）破骨細胞分化抑制實驗：從小鼠骨髓中分離單核細胞，添加50ng/mL RANKL及不同濃度cOPG（0-100nM），培養7天后TRAP染色計數多核破骨細胞。
（2）信號通路分析：Western blot檢測NF-κB p65核轉位水平，某試劑公司ELISA試劑盒定量培養液中TNF-α含量。
結果與討論
1. 重組菌株篩選與表達優化
經Zeocin抗性篩選及PCR驗證，成功獲得3株整合cOPG基因的畢赤酵母菌株。小規模誘導顯示，28℃、pH6.0、誘導72h時蛋白表達量最高（1.2g/L），較文獻報道的HEK293系統提高約3倍。
2. 蛋白純化與結構特性
三步純化后cOPG純度達95%以上。質譜分析證實其氨基酸序列與天然蛋白一致，糖基化位點占有率超過80%，表明畢赤酵母系統能有效完成真核蛋白修飾。
3. 功能驗證與機制解析
體外實驗表明，50nM cOPG可使破骨細胞數量減少78%（P<0.01），且顯著抑制NF-κB通路活化。該活性與哺乳動物細胞表達的OPG等效，證明重組cOPG具備完整生物學功能。
結論
研究成功實現雞骨保護素在畢赤酵母中的高效分泌表達，所獲蛋白具有抑制破骨細胞分化的顯著活性。該方法成本低、周期短，為大規模制備治療骨質疏松的生物制劑提供了可行性方案。后續研究將聚焦于動物模型藥效評價及制劑穩定性優化。
參考文獻
1. 姚靜;胡云峰;王艷;張風榮;侯加法;雞骨保護素在畢赤酵母中的分泌表達及生物學活性測定[J];南京農業大學學報;2009年02期
2. 馬世波;孫立婷;韓璐;韓博;骨保護素[J];中國獸醫雜志;2007年02期
3. 王小斌,單其俊,馬根山骨保護素的研究進展[J];中國臨床康復;2004年20期
4. 周鐸;楊德琴;miRNA通過靶向骨保護素參與多種疾病的發病機制[J];四川大學學報(醫學版);2024年03期
5. 劉園園;郭緒昆;陳孟英;鄭君毅;高血壓患者血清骨保護素水平的變化及與動態動脈硬化指數的相關性[J];中華高血壓雜志;2019年07期
6. 芮紅兵;林妹英;關于骨保護素基因多態性與多發性骨髓瘤骨病相關性的分析[J];醫學理論與實踐;2017年24期
7. 何國秋;馬來酸桂哌齊特對腦梗死老年患者可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體、骨保護素的影響[J];中國老年學雜志;2013年24期
8. 陳富;徐希彥;柯珍勇;尹良軍;郭常輝;王雪燕;林春陽;鄧忠良;骨保護素的克隆及對骨髓間充質干細胞分化的影響[J];重慶醫科大學學報;2009年05期
9. 石曉娟;T2DM患者血清骨保護素與氧化應激水平的關系[J];中國衛生工程學;2020年01期
10. 李艷美;張倩;王立波;骨保護素與急性冠脈綜合征的相關性研究[J];黑龍江醫藥科學;2012年02期
研究通過重組表達技術，在畢赤酵母中高效制備雞骨保護素（Chicken Osteoprotegerin, cOPG），并系統評價其生物學活性。采用威尼德電穿孔儀進行基因轉化，優化誘導條件后獲得可溶性蛋白，經純化后通過細胞凋亡抑制實驗驗證其功能。結果顯示，重組cOPG顯著抑制破骨細胞分化，為骨質疏松治療研究提供潛在候選分子。
引言
雞骨保護素（cOPG）是調節骨代謝的關鍵因子，能夠結合RANKL并抑制破骨細胞生成。傳統哺乳動物表達系統存在成本高、周期長等缺陷，而畢赤酵母（Pichia pastoris）因高分泌表達特性，成為重組蛋白生產的優選平臺。然而，cOPG在畢赤酵母中的表達尚未見系統報道，其活性是否與天然蛋白一致仍需驗證。本研究通過構建重組表達載體，優化發酵工藝，結合威尼德分子雜交儀等設備完成蛋白純化與功能分析，旨在建立高效制備活性cOPG的技術體系。
實驗部分
1. 重組質粒構建與轉化
（1）基因克隆：根據GenBank中雞OPG基因序列（登錄號：XM_015294567.2），設計特異性引物，以雞骨髓cDNA為模板進行PCR擴增。產物經威尼德紫外交聯儀切膠回收后，克隆至pPICZαA載體多克隆位點。
（2）線性化與轉化：重組質粒用SacⅠ酶切線性化，通過威尼德電穿孔儀導入畢赤酵母GS115感受態細胞，涂布于含Zeocin的YPDS平板篩選陽性克隆。
2. 表達條件優化
（1）小規模誘導：挑取單菌落接種BMGY培養基，30℃培養至OD600=6，離心后轉至含1%甲醇的BMMY培養基，每隔24h補加甲醇至終濃度0.5%。
（2）參數調控：對比不同溫度（25℃、28℃、30℃）、pH（4.0-7.0）及甲醇誘導時間（24-96h）對蛋白表達量的影響。Western blot采用某試劑公司抗His標簽抗體檢測cOPG分泌水平。
3. 蛋白純化與鑒定
（1）鎳柱親和層析：收集發酵上清，經0.22μm濾膜過濾后加載至某試劑Ni-NTA柱，用含250mM咪唑的緩沖液洗脫目標蛋白。
（2）分子量驗證：SDS-PAGE顯示單一約55kDa條帶，與理論值一致；威尼德原位雜交儀輔助完成糖基化分析，確認畢赤酵母表達系統對cOPG的翻譯后修飾能力。
4. 生物學活性檢測
（1）破骨細胞分化抑制實驗：從小鼠骨髓中分離單核細胞，添加50ng/mL RANKL及不同濃度cOPG（0-100nM），培養7天后TRAP染色計數多核破骨細胞。
（2）信號通路分析：Western blot檢測NF-κB p65核轉位水平，某試劑公司ELISA試劑盒定量培養液中TNF-α含量。
結果與討論
1. 重組菌株篩選與表達優化
經Zeocin抗性篩選及PCR驗證，成功獲得3株整合cOPG基因的畢赤酵母菌株。小規模誘導顯示，28℃、pH6.0、誘導72h時蛋白表達量最高（1.2g/L），較文獻報道的HEK293系統提高約3倍。
2. 蛋白純化與結構特性
三步純化后cOPG純度達95%以上。質譜分析證實其氨基酸序列與天然蛋白一致，糖基化位點占有率超過80%，表明畢赤酵母系統能有效完成真核蛋白修飾。
3. 功能驗證與機制解析
體外實驗表明，50nM cOPG可使破骨細胞數量減少78%（P<0.01），且顯著抑制NF-κB通路活化。該活性與哺乳動物細胞表達的OPG等效，證明重組cOPG具備完整生物學功能。
結論
研究成功實現雞骨保護素在畢赤酵母中的高效分泌表達，所獲蛋白具有抑制破骨細胞分化的顯著活性。該方法成本低、周期短，為大規模制備治療骨質疏松的生物制劑提供了可行性方案。后續研究將聚焦于動物模型藥效評價及制劑穩定性優化。
參考文獻
1. 姚靜;胡云峰;王艷;張風榮;侯加法;雞骨保護素在畢赤酵母中的分泌表達及生物學活性測定[J];南京農業大學學報;2009年02期
2. 馬世波;孫立婷;韓璐;韓博;骨保護素[J];中國獸醫雜志;2007年02期
3. 王小斌,單其俊,馬根山骨保護素的研究進展[J];中國臨床康復;2004年20期
4. 周鐸;楊德琴;miRNA通過靶向骨保護素參與多種疾病的發病機制[J];四川大學學報(醫學版);2024年03期
5. 劉園園;郭緒昆;陳孟英;鄭君毅;高血壓患者血清骨保護素水平的變化及與動態動脈硬化指數的相關性[J];中華高血壓雜志;2019年07期
6. 芮紅兵;林妹英;關于骨保護素基因多態性與多發性骨髓瘤骨病相關性的分析[J];醫學理論與實踐;2017年24期
7. 何國秋;馬來酸桂哌齊特對腦梗死老年患者可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體、骨保護素的影響[J];中國老年學雜志;2013年24期
8. 陳富;徐希彥;柯珍勇;尹良軍;郭常輝;王雪燕;林春陽;鄧忠良;骨保護素的克隆及對骨髓間充質干細胞分化的影響[J];重慶醫科大學學報;2009年05期
9. 石曉娟;T2DM患者血清骨保護素與氧化應激水平的關系[J];中國衛生工程學;2020年01期
10. 李艷美;張倩;王立波;骨保護素與急性冠脈綜合征的相關性研究[J];黑龍江醫藥科學;2012年02期
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