技術簡介

      研究不同生理病理條件下組織內蛋白質的表達水平的變化是比較蛋白質組學的核心內容。要揭示上述動態過程往往需要進行多個樣本的同步比較分析。近年來，在體內和體外穩定同位素標記基礎上，用多維相色譜分離多肽，進而用串聯質譜進行相對定量的分析方法已成為高通量比較蛋白質組研究的主要手段之一。

       iTRAQ（isobarictags for relative and absolute quantitation）技術是由美國AB Seiex公司研發的一種多肽體外標記技術。該技術采用多達8種穩定同位素標簽，通過特異性標記多肽的氨基基團，然后進行串聯質譜分析，可同時比較多達8種不同樣品中蛋白質的相對含量。

技術優點

  l  iTRAQ標記技術可在一次實驗同時對多達8個樣本進行定量分析，降低了反復實驗引入的技術誤差，8個樣品之間可進行任意兩兩比較，增加實驗設計的靈活性。可用于多個時間點蛋白質組動態變化的監測、；靈活增加實驗重復/技術重復以及進行多個個體樣本的研究。

  l  該技術為體外標記，可標記各種動物組織、植物組織、微生物、體液、細胞等樣本。

  l  重復性好，靈敏度高，蛋白覆蓋范圍廣，在單張譜圖中同時進行定性與定量。

  l  標記完全，標記效率高達97%以上，等質量的同位素標簽不增加樣品的復雜程度。

  l  一次實驗可定量3000-5000種蛋白(2個unique peptides以上)。

技術原理

  l  iTRAQ試劑由三部分組成：1）報告基團（reportergroup）相對分子質量分別為113、114、115、116、117、118、119和121Da；2）平衡基團（balance group）相對分子質量分別為192、191、190、189、187、186和184 Da； 3）反應基團（peptide reactive group）形成8種分子量為305 Da的等質量同位素標簽。

  l  iTRAQ試劑標記酶解后的肽段，可與氨基酸N端及側鏈的一級胺發生反應。在一級譜圖中，來自于不用樣品的同一肽段，標記后，表現為相同的質荷比。

  l  在二級質譜中，報告基團、平衡基團和反應基團之間的鍵斷裂，帶不同同位素標簽的同一肽段產生質量為113、114、115、116、117、118、119和121Da的報告離子，根據報告離子的豐度可獲得樣品間相同肽段的定量信息，再經過軟件處理得到蛋白質的定量信息。

實驗流程

送樣標準

l  動物組織的樣品量濕重不少于200mg。

l  植物或真菌、細菌、噬菌體等微生物類樣品量濕重不少于2g。

l  富含雜質或蛋白質含量低的樣品量濕重不少于5g；如植物的根，木質部、韌皮部組織等。

l  體液類（唾液、羊水、腦脊液等）10ml以上，要保證不能溶血；血清要求500ul以上；尿液要求50ml以上。

l  如直接提供蛋白質提取物，濃度不少于2mg/ml，總量不少于1mg。為保證實驗效果，請盡量告知緩沖液成分，如是否有硫脲、SDS、強離子鹽等等。另樣品中應不含核酸、脂類、多糖等影響分離效果的成分。

l  在細胞器蛋白質組學方面，提取細胞器或亞細胞器的工作在原則上不予處理，由客戶自行提取后送樣，蛋白沉淀量在1mg以上；特殊情況可與商務人員具體商議。