——即蛋白質藥物的糖型分析技術服務

糖基化在生物系統中重要功能，準確鑒定蛋白質多肽類藥物的糖基化情況是蛋白藥物監管指導原則中的一部分。相對分子質量作為蛋白質樣品的主要特征參數之一，是確定一種新型蛋白、進行蛋白質后續研究活動的重要前提。

隨著現代分析技術的發展，特別是高分辨質譜技術——高分辨的準確質量數（HR/AM）Orbitrap質譜能夠實現蛋白質相對分子量的測定。APT通過分別測定脫糖前后樣品的分子量，其差值即為糖鏈的分子量，進而根據分子量推測其糖型。

“抗體類蛋白質藥物的糖型定性定量分析是質控分析中的重要組成部分”

技術指標

APT糖型分析的樣品純度在99%以上，脫糖由PNGaseF酶處理，樣品由Q Exactive質譜儀（Thermo Finnigan）進行質譜分析。分析時長：20min；檢測方式：正離子；母離子掃描范圍：1000-4000m/z；一級質譜分辨率：17500；AGC target：3e6；In-source CID：45eV；Maximum IT：250ms。

技術原理

糖基化對蛋白的生物活性至關重要，因此，需要對多批次抗體的糖基化形式都進行表征，檢測其糖基化形式的變化范圍，之后證明該單抗藥物的糖型結構在參照糖型的變化范圍內。抗體糖基化修飾的表征分為3個層面：全抗體糖型分析、糖基化位點分析、寡糖鏈分析。

利用高分辨率分子量測定對全抗體糖型進行分析時，是根據脫糖前后蛋白質的高分辨率分子量結果，可以計算出其糖鏈的分子量。與抗體類蛋白質藥物常見的一些糖基化修飾相對照，可以確定其糖型。從去卷積后的分子量圖譜中和質譜峰面積可以獲得相應的糖型以及比例關系。

幾種常見的抗體糖基化修飾

案例分析

下面兩幅圖譜分別表示樣品脫糖前、后的相對分子質量。

圖為糖型分析中脫糖前的高分辨率質譜計算出的相對分子質量

圖為糖型分析中脫糖后的高分辨率質譜計算出的相對分子質量

該項目原始數據由Protein Deconvolution Version 1.0 (Thermo)軟件處理，采用ReSpectTM算法。參數設置：Charge Carrier：H+；Noise Rejection：95% confidence；Target Mass：150000；Minimum Adjacent Charges：15；Mass Tolerance：0.05Da。

樣品分別測定脫糖前后的分子量，差值即為糖鏈的分子量，進而根據分子量推測其糖型。根據圖譜中樣品脫糖前后分子量的差異得出樣品中3種主要糖鏈的分子量：2891.40 Da，3054.94 Da，3213.96 Da。通過樣品所含糖鏈的實測分子量與幾種類型N-糖的理論分子量進行匹配后發現，G0F/ G0F、G0F/ G1F、G1F/ G1F三種N-糖的分子量與實測分子量非常接近，與單克隆抗體所具有的N-糖類型相符。3種糖鏈分子量差值分別為163.5 Da和159.0 Da，根據已知的糖型可知3種糖鏈之間相差一個半乳糖。

用質譜峰面積（Protein Deconvolution 1.0）計算3種糖型的分子量，結果為G0F/ G0F : G0F/ G1F : G1F/ G1F=X : X : X。

Q&A

1)   糖型的定性分析和高分辨率分子量測定之間的關系。

糖基化對蛋白的生物活性至關重要，因此，需要對多批次抗體的糖基化形式進行表征，檢測其糖基化形式的變化范圍。之后證明該單抗藥物的糖型結構在參照的糖型的變化范圍內。抗體糖基化修飾的表征分為3個層面：全抗體糖型分析、糖基化位點分析、寡糖鏈分析。我們是采用高分辨率分子量測定對全抗體糖型進行分析。

2)   脫糖前后的糖基化蛋白質高精度分子量分析方法。

根據脫糖前后蛋白質的高分辨率分子量結果，可以計算出其糖鏈的分子量。與抗體類蛋白質藥物常見的一些糖基化修飾相對照，可以確定其糖型。從去卷積后的分子量圖譜中和質譜峰面積可以獲得相應的糖型以及比例關系。