近年來，RNA修飾所介導(dǎo)的基因表達調(diào)控不斷取得突破性進展，直接導(dǎo)致了表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Epitranscriptomics）的誕生。最新研究發(fā)現(xiàn)，m6A、m5C、m1A、hm5C、甲尿嘧啶（ψ）與肌苷（I）等多種表觀轉(zhuǎn)錄修飾存在于mRNA上，影響mRNA的代謝與功能^[1] ，是一種重要的基因表達調(diào)控方式（圖1）。這些表觀轉(zhuǎn)錄組修飾由特定的酶添加（Writer）或去除（Eraser），可被特定的蛋白識別（Reader）。表觀轉(zhuǎn)錄修飾水平的異常，以及相關(guān)酶或蛋白的異常，與許多疾病的發(fā)生緊密關(guān)聯(lián)。
    m6A是真核生物mRNA上含量最豐富的表觀轉(zhuǎn)錄修飾，參與調(diào)控mRNA的二級結(jié)構(gòu)、剪切、成熟、細胞定位與翻譯等過程。m6A由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（包含METTL3，METTL14，WTAP，KIAA1429，RBM15，RBM15B）催化產(chǎn)生，可被去甲基化酶ALKBH5或FTO去除。目前已發(fā)現(xiàn)了多種特異性識別m6A位點的蛋白或復(fù)合物，包括YTH家族蛋白（YTHDF1-3， YTHDC1）、轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物eIF3、核糖核蛋白（HNRNPA2B1，HNRNPC）以及RNA結(jié)合蛋白SRSF2（表1）。m6A的動態(tài)調(diào)控在減數(shù)分裂與細胞多潛能分化等過程中發(fā)揮著重要作用^[3] 。與正常組織相比，腫瘤干細胞中的m6A修飾水平顯著升高。高水平的m6A增強了多個關(guān)鍵腫瘤基因的蛋白表達，從而促進腫瘤干細胞的增殖與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且常與不良預(yù)后有關(guān)。此外，METTL3^[4] 、FTO^[2]及ALKBH5^[5]等表觀轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)中也發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。在病毒RNA上也檢測到了m6A修飾，其與病毒感染及復(fù)制有關(guān)。
    顯而易見，表觀轉(zhuǎn)錄修飾與表觀轉(zhuǎn)錄修飾相關(guān)蛋白在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，目前對其研究才剛剛起步。為了幫助研究人員更方便快捷的進行表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，Arraystar開發(fā)了市場上首款檢測表觀轉(zhuǎn)錄修飾相關(guān)蛋白因子的PCR芯片。此款芯片可同時檢測89個已知的或潛在的表觀轉(zhuǎn)錄修飾相關(guān)蛋白，是表觀轉(zhuǎn)錄研究的強有力工具。

圖1. mRNA表觀轉(zhuǎn)錄修飾及其生物學(xué)功能。
 

表1. 已發(fā)現(xiàn)的人屬mRNA修飾酶（writer）、去修飾酶（Eraser）和修飾識別蛋白（Reader）。

產(chǎn)品信息：

芯片特點：
• 覆蓋度廣—覆蓋了所有目前已知的表觀轉(zhuǎn)錄修飾相關(guān)蛋白
• 轉(zhuǎn)錄本水平檢測—檢測編碼Uniprot經(jīng)典蛋白的轉(zhuǎn)錄本
• 嚴謹性強—所有引物都通過了多樣本嚴格驗證
• 快速簡易—即用型384孔板規(guī)格，只需將cDNA與qPCR Master Mix混合試劑加入PCR板中，4小時內(nèi)得到實驗結(jié)果。cDNA無需預(yù)先擴增。

PCR芯片實驗流程
1.RNA抽提與質(zhì)量檢測
進行RNA常規(guī)抽提，使用NanoDrop ND-1000檢測RNA濃度和純度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。詳細的樣品QC結(jié)果見Arraystar服務(wù)報告。
2.cDNA合成
每樣本取1.5 μg RNA，使用rtStar™ First-Strand Synthesis Kit (Cat# AS-FS-001, Arraystar) 試劑盒合成cDNA第一鏈。詳細步驟參照Arraystar產(chǎn)品操作手冊。
3.Real-time PCR擴增
將cDNA與 Arraystar SYBR Green qPCR Master Mix (Cat# AS-MR-005-5, Arraystar)混合，加入至384孔板中，在ABI 7900 PCR儀上進行Real-time PCR擴增。
4.熔解曲線分析與原始數(shù)據(jù)導(dǎo)出
PCR擴增完成后，進行熔解曲線分析，使用PCR儀自帶軟件導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)。出具Raw Data文件夾，包含原始Ct值、PCR擴增曲線圖和熔解曲線圖。

PCR芯片數(shù)據(jù)分析流程
1.PCR芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控
 質(zhì)控參數(shù)：Ct(Blank)>35; Ct(GDC)>35; Ct(RNA Spike-in)<25; Ct (PPC) <25. 符合上述條件的樣本進入下一步分析。
2.數(shù)據(jù)校正與△Ct值計算
板間校正：使用Ct(PPC)對不同PCR板進行板間校正。
內(nèi)參校正與△Ct值計算：挑選最優(yōu)內(nèi)參，使用內(nèi)參均值計算△Ct值。
3.差異倍數(shù)計算 (2^(-△△Ct))
使用 △△Ct 方法計算不同樣品組之間的表達差異倍數(shù)。
4.P值計算
對樣本組進行t檢驗，計算P值。
5.其他常規(guī)數(shù)據(jù)分析
散點圖分析；火山圖分析；TOP20表達上調(diào)和下調(diào)transcript柱形圖分析
6.提供服務(wù)報告與數(shù)據(jù)分析結(jié)果
a.Arraystar服務(wù)報告（包括RNA樣本QC和詳細實驗數(shù)據(jù)分析步驟）
b.Excel芯片結(jié)果匯總表（包括transcript列表，數(shù)據(jù)分析結(jié)果和各類圖表）
c.Raw Data文件夾 (包含原始數(shù)據(jù)、擴增曲線圖和熔解曲線圖)

NuRNA™ Human Epitranscriptomics PCR芯片服務(wù)部分結(jié)果展示
1.差異表達轉(zhuǎn)錄本列表（默認篩選參數(shù)：差異倍數(shù)>2；P<0.05，客戶可指定篩選參數(shù)值）

2.散點圖 (黑色斜線代表差異倍數(shù)為1，紅色斜線代表差異倍數(shù)為2)

3.火山圖（黑色垂線代表差異倍數(shù)為1；粉色垂線代表上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)為2；藍色水平線代表P值為0.05）

4.TOP20表達上調(diào)transcript柱狀圖

5.TOP20表達下調(diào)transcript柱狀圖

參考文獻
1. Gilbert, W.V., et al. (2016). Messenger RNA modifications: Form, distribution, and function. Science 352, 1408-1412, PMID:27313037.
2. Iles, M.M., et al. (2013). A variant in FTO shows association with melanoma risk not due to BMI. Nature genetics 45, 428-432, 432e421, PMID:23455637.
3. Klungland, A., et al. (2016). Reversible RNA modifications in meiosis and pluripotency. Nature methods 14, 18-22, PMID:28032624.
4. Lin, S., et al. (2016). The m(6)A Methyltransferase METTL3 Promotes Translation in Human Cancer Cells. Molecular cell 62, 335-345, PMID:27117702.
5. Zhang, C., et al. (2016). Hypoxia induces the breast cancer stem cell phenotype by HIF-dependent and ALKBH5-mediated m(6)A-demethylation of NANOG mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 113, E2047-2056, PMID:27001847.