實時熒光定量PCR原理、特點和應用領域介紹
實時熒光定量PCR原理、特點和應用領域介紹
聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)可對特定核苷酸片斷進行指數級的擴增。在擴增反應結束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析，也可以通過放射性核素摻入標記后的光密度掃描來進行定量的分析。無論定性還是定量分析，分析的都是PCR終產物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經PCR信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉基因動植物轉基因的拷貝數或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下熒光定量PCR技術應運而生。
實時熒光定量PCR技術（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction簡稱Real Time PCR）是在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied biosystems公司推出，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環變得“可見”，最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進行定量的方法。實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數最敏感、最準確的方法。如果用于RNA檢測，這被稱為逆轉錄實時PCR即（Real-time RT-PCR）是實時PCR法，它是指對DNA或經過反轉入（RT-PCR）的RNA通過聚合酶鏈式反應并實時監測DNA的放大過程，在擴增的指數增長期就測量擴增產物，因為擴增指數增長期測量值與特異DNA（RNA）起始量存在相關性，從而實現定量檢測。RealTime PCR的基本目標是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監測CT值而實現對原始目標基因的含量定量。實時熒光定量PCR法最大的優點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差，實現DNA/RNA的精確定量。該技術不僅實現了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該技術在醫學臨床檢驗及臨床醫學研究方面有著重要的意義。
microRNA實時熒光定量PCR的技術特點
雖然microRNA實時定量PCR是一種最近才發展起來的檢測技術，其技術細節還在不斷完善中，但是microRNA實時定量PCR檢測系統，相對其它microRNA檢測技術有以下優點：
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高特異性，可以只對成熟microRNA進行定量，有效區分成熟microRNA分子和前體分子以及其它成熟microRNA的同源分子；
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快速，簡單，省時，整個操作只需兩步，不到3個小時，即可獲得高質量的數據；
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檢測靈敏度高，樣品消耗少，僅需1-10ng的總RNA或50pg左右的microRNA；
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超寬的線性范圍，可跨越7個數量級。
實時定量PCR的系統構成及工作原理
熒光定量檢測系統由實時熒光定量PCR儀，實時熒光定量試劑，通用電腦，自動分析軟件等構成。設備由熒光定量系統和計算機組成，用來監測循環過程的熒光。
與實時設備相連的計算機收集熒光數據。數據通過開發的實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數據被繪制成熒光強度相對于循環數的圖表。原始數據收集后可以開始分析。實時設備的軟件能使收集到的數據進行正常化處理來彌補背景熒光的差異。正常化后可以設定域值水平，這就是分析熒光數據的水平。樣品到達域值水平所經歷的循環數稱為Ct值（限制點的循環數）。域值應設定在使指數期的擴增效率為最大，這樣可以獲得最準確，可重復性的數據。如果同時擴增的還有標有相應濃度的標準品，線性回歸分析將產生一條標準曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。
所謂Real-time Q-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time技術的發展過程中，兩個重要的發現起著關鍵的作用：
- 在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發現，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產物成為可能。
- 此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應管中能實時地監測反應全過程。這兩個發現的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發展導致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運用。
定量PCR儀的梯度功能：對于使用染料法的定量PCR反應，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經驗公式計算熔解溫度（Tm值），但運用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變萬化，對于特殊片斷，經驗公式得到的數據不一定能得出準確的結果，退火溫度細微的差異對結果都可能產生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現部分解決了一些問題——在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在指定范圍內按照梯度變化，根據結果，一步就可以摸索出最適合的反應條件。
不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數高保真Taq酶來說這個非常重要，因為Taq和校正酶的最佳反應溫度可能有顯著差異，優化延伸溫度就顯得很重要。使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實驗才能完成的優化過程，簡化了摸索 PCR反應條件的繁瑣實驗，既節省實驗時間提高效率，又節省實驗成本。
PCR反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數方式增加的，隨著反應循環數的增加，最終PCR反應不再以指數方式生成模板，從而進入平臺期。在傳統的PCR中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應的最終擴增產物，因此用此終點法對PCR產物定量存在不可靠之處。在real-timeQ-PCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監測和連續地分析擴增相關的熒光信號，隨著反應時間的進行，監測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應早期，產生熒光的水平不能與背景明顯地區別，而后熒光的產生進入指數期、線性期和最終的平臺期，因此可以在PCR反應處于指數期的某一點上來檢測PCR產物的量，并且由此來推斷模板最初的含量。
為了便于對所檢測樣本進行比較，在real-timeQ-PCR反應的指數期，首先需設定一定熒光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號（baseline），熒光域值的缺省設置是3～15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環數（Ct）。Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
1、Ct值的定義
在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。
2、熒光域值（threshold）的設定
PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle6-15
3、Ct值與起始模板的關系
研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系〔1〕，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
4、熒光化學
4、熒光化學
熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現將其原理簡述如下：
1）TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5－3外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平臺。
2）SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
實時熒光定量PCR技術的應用領域
實時熒光定量PCR技術是DNA定量技術的一次飛躍。運用該項技術，我們可以對DNA、RNA樣品進行定量和定性分析。定量分析包括絕對定量分析和相對定量分析。前者可以得到某個樣本中基因的拷貝數和濃度；后者可以對不同方式處理的兩個樣本中的基因表達水平進行比較。除此之外我們還可以對PCR產物或樣品進行定性分析：例如利用熔解曲線分析識別擴增產物和引物二聚體，以區分非特異擴增；利用特異性探針進行基因型分析及SNP檢測等。目前實時熒光PCR技術已經被廣泛應用于基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發等領域。其中最主要的應用集中在以下幾個方面：
- DNA或RNA的絕對定量分析。包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉基因動植物拷貝數的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。
- 基因表達差異分析。例如比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等)，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA或差顯結果的確證。
- 基因分型。例如SNP檢測，甲基化檢測等。
實時熒光定量PCR技術在醫療方面的應用：
病原體檢測：
目前，采用熒光定量PCR檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、肝炎病毒、結核桿菌、細小病毒B19、EB病毒和人巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優點。
目前，采用熒光定量PCR檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、肝炎病毒、結核桿菌、細小病毒B19、EB病毒和人巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優點。
遺傳及優生優育診斷：
到目前為止，人們對遺傳性物質改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產前監測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區基因是一種無創傷性的方法，易為孕婦所接受。例外還可以通過實時熒光定量PCR對孕婦弓形蟲，梅毒等檢測，這對找出不明原因流產和習慣性流產的病因提供有力的幫助，大大提高優生優育。
到目前為止，人們對遺傳性物質改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產前監測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區基因是一種無創傷性的方法，易為孕婦所接受。例外還可以通過實時熒光定量PCR對孕婦弓形蟲，梅毒等檢測，這對找出不明原因流產和習慣性流產的病因提供有力的幫助，大大提高優生優育。
指導治療：
對病原體定量分析顯示：病原體量與某些藥物的療效關系。如HCV高水平表達，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發生變異等。
對病原體定量分析顯示：病原體量與某些藥物的療效關系。如HCV高水平表達，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發生變異等。
腫瘤基因檢測：
盡管腫瘤發病的機理尚未清楚，但相關基因發生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。p53癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現。實時熒光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。隨著與腫瘤相關的新基因的不斷發現，熒光定量PCR技術將會在腫瘤的研究中發揮更大的作用。
盡管腫瘤發病的機理尚未清楚，但相關基因發生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。p53癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現。實時熒光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。隨著與腫瘤相關的新基因的不斷發現，熒光定量PCR技術將會在腫瘤的研究中發揮更大的作用。
免疫方面檢測：
通過熒光定量PCR檢測出B27，HLA等來幫助診斷免疫性疾病，如強直性脊柱炎、類風濕性關節炎、器官移植排異反應等。
通過熒光定量PCR檢測出B27，HLA等來幫助診斷免疫性疾病，如強直性脊柱炎、類風濕性關節炎、器官移植排異反應等。
實時熒光定量PCR技術在藥物研究方面的應用：
新藥開發研究，
人用藥物及其他藥物：針對一些感染性疾病的藥物，如各種病毒病、細菌病等，在新藥的開發過程中，快速了解藥物對疾病進程的影響可以為新藥開發節約大量的人力、時間和資金，與以前所用的Elisa等方法相比，實時熒光定量PCR技術可以快速、準確、定量、靈敏地測定血液或組織中病原體的含量，因此有利用分析藥物的作用效果，為比較不同的配方的療效、用藥量、用藥時間等等提供快速、定量的評價。
超早期感染用藥物及療法的研究與開發：
實時熒光定量PCR方法測定是血液中病毒核酸的含量，因此不必等到病人體內產生抗體，同時，由于其靈敏度與Elisa相比不可同日而語，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低時就可以測定。因此就出現了一個新的領域，即在病毒或細菌含量很低時如何用藥，用什么藥以及用藥量等進行研究，為將疾病消滅在超早期作出貢獻。
藥物療效研究：
對于一些已經上市的新藥或是應用了很長時間的老藥，其用藥的效果以及用藥量及用藥時間都可以進行進一步的研究，為更加合理化的應用這些藥物為人類造福進行進一步的研究。以前所用的方法由于不能準確定量，靈敏度也不夠，因此有很多需要研究的內容沒有完成。這一方面需要研究內容很多，意義也很大。
新的愈后指標的研究：
對于感染性疾病，在藥物作用至一定程度后，就認為可以停藥了，但是應該在什么停藥，現在大都沒有一個明確的指標，現在所用的指標由于受到檢測方法的靈敏度及準確性限制，這一指標未必合理，因此有必要對治愈的指標以及指標與復發率以及疾病轉化為其他疾病之間的關系等進行進一步的研究，從而為藥物或療法徹底治愈疾病打下堅實的理論基礎。
新診斷及檢驗試劑的開發：
現有的很多診斷及檢驗方法都不能同時滿足快速、靈敏、定量的要求如現有培養法、Elisa法等等，而熒光定量PCR方法以則可以做到這一點，從而可為臨床疾病、商檢、糧油檢驗、食品檢驗、血液檢驗等等開發新的試劑，從而提高檢驗的靈敏度、速度及準確性等；這類試劑的種類是非常多的，所開發的試劑的社會效益及經濟效益都是很巨大的。
新藥開發研究，
人用藥物及其他藥物：針對一些感染性疾病的藥物，如各種病毒病、細菌病等，在新藥的開發過程中，快速了解藥物對疾病進程的影響可以為新藥開發節約大量的人力、時間和資金，與以前所用的Elisa等方法相比，實時熒光定量PCR技術可以快速、準確、定量、靈敏地測定血液或組織中病原體的含量，因此有利用分析藥物的作用效果，為比較不同的配方的療效、用藥量、用藥時間等等提供快速、定量的評價。
超早期感染用藥物及療法的研究與開發：
實時熒光定量PCR方法測定是血液中病毒核酸的含量，因此不必等到病人體內產生抗體，同時，由于其靈敏度與Elisa相比不可同日而語，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低時就可以測定。因此就出現了一個新的領域，即在病毒或細菌含量很低時如何用藥，用什么藥以及用藥量等進行研究，為將疾病消滅在超早期作出貢獻。
藥物療效研究：
對于一些已經上市的新藥或是應用了很長時間的老藥，其用藥的效果以及用藥量及用藥時間都可以進行進一步的研究，為更加合理化的應用這些藥物為人類造福進行進一步的研究。以前所用的方法由于不能準確定量，靈敏度也不夠，因此有很多需要研究的內容沒有完成。這一方面需要研究內容很多，意義也很大。
新的愈后指標的研究：
對于感染性疾病，在藥物作用至一定程度后，就認為可以停藥了，但是應該在什么停藥，現在大都沒有一個明確的指標，現在所用的指標由于受到檢測方法的靈敏度及準確性限制，這一指標未必合理，因此有必要對治愈的指標以及指標與復發率以及疾病轉化為其他疾病之間的關系等進行進一步的研究，從而為藥物或療法徹底治愈疾病打下堅實的理論基礎。
新診斷及檢驗試劑的開發：
現有的很多診斷及檢驗方法都不能同時滿足快速、靈敏、定量的要求如現有培養法、Elisa法等等，而熒光定量PCR方法以則可以做到這一點，從而可為臨床疾病、商檢、糧油檢驗、食品檢驗、血液檢驗等等開發新的試劑，從而提高檢驗的靈敏度、速度及準確性等；這類試劑的種類是非常多的，所開發的試劑的社會效益及經濟效益都是很巨大的。
實時熒光定量PCR技術在檢測人感染A（H1N1）型豬流感病毒上的應用：
2009年4月，全球性的人感染豬流感公共衛生事件發展勢頭迅猛，發生國家眾多，世界衛生組織29日晚已將全球流感大流行警告級別從4級提高到5級，我國也于28日召開了國務院常務會議對防控進行了部署。現在已進入關鍵的防控措施落實階段，其中檢測與診斷技術至關重要。
人感染豬流感疫情發生后，美國疾病預防控制中心（CDC）于2009年4月28日發布了針對人感染豬流感病毒治療和預防臨時指南，其中規定了確診病例的診斷方法：具有急性發燒呼吸道疾病的臨床癥狀并且經實時熒光定量PCR(real-timeRT-PCR)或病毒分離培養(viralculture)實驗室檢測方法檢驗證實感染A（H1N1）型豬流感病毒。
標簽：
實時熒光定量PCR 原理 應用
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