1.針對目的基因序列選擇合適的擴增片斷

查看以下三個網站是否有合適的已經證實的QRT-PCR的擴增引物,探針以及反應條件.

RTPrimerDB (http://medgen.ugent.be/rtprimerdb), 相對物種較多

PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html) 人，鼠

Real Time PCR Primer Sets (http://www.realtimeprimers.org) 人，mouse，rat

如果沒有合適的或者已經證實的可以提供參考,以下的設計方案僅供參考:

A.最廣泛使用的商業化的軟件Beacon Designer(http://www.premierbiosoft.com)

B.DIY的軟件Primer Express

C.如果Beacon Designer 無法得到您說需要的結果,或者獲得到設計方案的備選數目不夠的話,可以選擇Sigma-Genosys http://)的服務方案,詳細周到

D.一個免費的基于網頁構架的引物和探針設計程序: http://www.biosearchtech.com/products/probe_design.asp

您可以挑選其中的4-6對引物進行試驗,選擇引物的擴增效率和靈敏度高的.這個軟件可以直接與NCBI的網站進行比對,并且用NCBI的ePCR進行虛擬的電子PCR

引物設計簡介

DNA引物長度:15-25 個堿基

GC含量:50%左右

如果引物的與AT區域富集結合,可以考慮用LNA替換幾個堿基,較少引物的長度以及避免引物次級結構和3’端二聚體的影響.由于引物和模板和探針與靶點之間的分之間的相互競爭,分之內雜交,倒轉重復等等會引起引物的引發探針對結合效率達降低,因此我們選擇引物二聚體的△G為負值,即:<10 kcal/mol.沒有連續的G/C.

引物探針的保存一般遵循以下原則:

正向和反向引物保存在-20度, 濃度為10mM 或者10×工作濃度.探針應該避光保存，貯存在-70度,最好以凍干粉狀態，工作濃度的液體保存一般兩周左右。

2.輸入靶序列，用BLASTn在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast進行比對

3.檢查比對序列的多態性以及可能的錯誤避免這些區域來進行引物和探針設計

4.在靶序列中避免直接待重復區，在重復區進行雜交容易使得引物非獲得產物性結合，降低DNA的擴增效率以及減少分析的靈敏度。

5.考慮到潛在的剪接變異體以及合適的所需要的獲得到靶，通過學分析內含子以及外顯子的邊界，主要通過cDNA和基因組序列比對來確定。一般都設計跨最長內含子區，這樣減少了擴增子受到基因組DNA的污染的影響。這是十分有必要的，特別當用DNA做歸一化處理以及靶向某一特異的剪接變異體。最經濟的做法是讓下游引物跨越剪接接頭，這樣允許使用一條探針檢測可能剪接變異體.然后如果在有效性和靈敏度無法保證情況下，可以使用跨越單一外顯子的設計方案。我們還是建議試驗者用DnaseI處理樣品，除去gDNA的污染。

6.在RT步驟時，用(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi)工具檢測在特定溫度下靶序列的折疊情況，避免一些高度次級結構的區域，那些區域探針和引物結合效率較低

7.盡可能用60-150bp的擴增產物，GC含量在60％或者稍小來確定高效的變性，更高度反應效率。GC含量高度序列容易產生非特異性的反應，短序列擴增是的擴增時間縮短gDNA污染可能性減少。短的序列容易人工合成，用來做擴增多標準曲線。用oligodT進行逆轉錄最好設計擴增子位于靠近模板的3’區域。