β-AP對衰老模型大鼠開場行為及學習記憶能力的影響

　　摘要:用D-半乳糖(D-gal) 建立衰老動物模型且海馬內微注射βAP ,檢測各組大鼠開場行為、Y-迷宮分辨學習和一次性被動回避反應的變化的方法,研究β-淀粉樣蛋白(βAP) 對衰老大鼠開場行為及學習記憶能力的影響. 結果是D-gal + NS 組、D-gal +βAP 組大鼠在新異環境中自發活動和探究行為減少,學習記憶減退,與NS + NS 組比較有顯著性差異( P < 0. 05 , P < 0. 01) . 該文得出的結論是βAP 與D-gal 聯合使用可導致腦老化程度加重,學習記憶能力顯著減弱.

關鍵詞:β-淀粉樣蛋白; 開場行為; 學習記憶; 衰老

　　β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein ,βAP) 是老年性癡呆患者的大腦中特有的一種蛋白,它在老年性癡呆的發病機理中的作用已引起人們的重視. 生化研究表明,β-淀粉樣蛋白是老年性癡呆患者腦海馬和皮層老年斑(SP) 的主要成分,它與AD 的病理形成過程關系密切. 已有報道βAP 對正常大鼠海馬神經元的毒害作用[1 ,2 ] ,但有關βAP 對衰老大鼠的作用,國內外均未見報道,本實驗試圖在D-半乳糖所致衰老動物模型基礎上進行海馬內注射βAP ,觀察其對大鼠開場行為和空間分辨學習以及記憶保持能力的影響.

1 　材料與方法

1. 1 　動物和試劑

雄性健康SD 大鼠,體重100～120 g,βAP 為Sigma 公司產品(βAP1 -40 ,Lot NO.76H49611) ,D-半乳糖(D-gal) 為上海試劑二廠產品.

1. 2 　分組和模型建立

將大鼠隨機分成4 組: ①生理鹽水NS + NS組; ②NS +βAP 組; ③D-gal + NS 組; ④D- gal +βAP組. ③、④組動物腹腔注射D-半乳糖:50 mg·kg - 1·d - 1 ,連續注射6 周建立衰老動物模型[3 ] ; ①、②組動物腹腔注射等量生理鹽水. 于第4 周進行雙側海馬內注射βAP , 每側注射1μL (4μg/μL) ;對照組注射等量生理鹽水. 海馬定位注射方法:大鼠腹腔注射4 %戊巴比妥鈉(40 mg. kg - 1) 麻醉,立體定位儀(日本NARISHIGE SN - 3 型) 上固定,坐標按照圖譜[4 ] ,以前囪定位:AP = - 3. 5 mm ,ML = ±2. 0mm ,H = 2. 7 mm ,鉆開顱骨,用微量進樣器垂直進針,每側注射時間為5min ,留針5min ,緩慢起針,局部消毒后縫合皮膚,肌注抗生素抗感染.

1. 3 　行為學檢測

連續腹腔內注射6 周后進行.

1. 3. 1 　開場行為(open field) [5 ] :

將動物置于圓形開場檢測箱底中央的格內,記錄其在3 min 跑動(locomotion) 穿過的格數,后肢站立( rearing) 次數、梳理(groo ming) 次數及糞便顆粒數. 比較不同組間大鼠在新異環境中自發行為和探究行為表現的差異.

1. 3. 2 　Y - 迷宮分辨學習( Y-maze discri minationlearning) 能力檢測[6 ] :Y-迷宮為三等分輻射式反射箱. 以大鼠被電擊后逃至安全區為一次正確反應,連續10 次測試中有9 次(90 %) 正確反應,定為學會標準. 記錄每個大鼠達到學會標準的訓練次數. 所有檢測過程均由計算機完成.

1. 3. 3 　一次性被動回避反應(one- t rial passiveavoidance response) [5 ] :

根據大鼠趨暗習性,記錄其在通道上的停留時間,即步入潛伏期(step- through latency , STL) ;動物進入暗箱后立即給予電擊(0. 3 mA ,5 s) ;24 h 后檢測大鼠的STL. 以STL 作為記憶保持的指標,STL越長表明對電擊的記憶保持越好. 檢測以240 s 為限.本實驗數據用( X ±S .X ( X 表示,組間差異用t檢驗;一次性被動回避反應采用Mann-whitney 非參數檢驗.

2 　結　　果

2. 1 　不同組大鼠開場行為觀察

結果見表1，統計處理表明,在開場行為諸參數中,D-gal +βAP 組動物與NS + NS 組比較糞便顆粒數有顯著性差異( P < 0. 05) ,而跑動格數則極明顯減少( P < 0. 01) ,前者在新異環境中自發活動和探究反應明顯下降,緊張恐懼狀態也降低. D-gal + NS組動物跑動格數與NS + NS 組比較也有顯著性差異( P < 0. 05) . NS + NS 組與NS +βAP 組之間雖無顯著性差異,但其跑動格數、站立次數均有下降趨勢,說明βAP 單獨使用對大鼠在新異環境中的自發活動及探究行為也有一定影響.

表1 　β-淀粉樣蛋白對大鼠開場行為的影響

組別             n      跑動格數         后肢站立次數     糞便顆粒數

NS + NS      10  86. 6 ±7. 5        23. 6 ±2. 3     4. 0 ±1. 9

NS +βAP      9   73. 8 ±9. 6        20. 3 ±3. 1     3. 1 ±2. 0

D-gal + NS   9   69. 3 ±9. 8^*      18. 8 ±1. 9     3. 0 ±1. 6

D-gal +βAP  9   46. 7 ±5. 8^**△  15. 7 ±2. 2     1. 3 ±0. 2^*

*P < 0. 05 , **P < 0. 01 vs NS + NS group ,

△P < 0. 05 vs D-gal + NS group.

2. 2 　Y-迷宮分辨學習能力檢測

達到學會標準所需訓練的次數,NS + NS 組:21. 4 ±2. 6 ;NS +βAP 組:34. 6 ±5. 5 ;D-gal + NS 組:42. 4 ±5. 4 ;D-gal +βAP 組:48. 0 ±5. 6. 前兩者比較無顯著性差異( P > 0. 05) ,D-gal + NS 組與NS + NS組比較有顯著性差異( P < 0. 05) ,而D-gal +βPA 組與NS + NS 組比較,達到學會標準所需訓練次數極明顯增加( P < 0. 01) ,說明D- gal 所致衰老模型大鼠的分辨學習能力顯著降低,而在衰老動物模型上海馬內注射βAP 更使學習能力極顯著下降.

2. 3 　一次性被動回避反應

從表2 可見D-gal +βAP 組記憶保持能力明顯下降,電擊后24 hSTL 顯著縮短,與NS + NS 組和D- gal + NS 組比較有顯著性差異( P < 0. 05) . 其他組之間比較,差異無顯著性,但記憶保持能力呈逐漸降低趨勢.

表2 　β-淀粉樣蛋白對大鼠步入行為的影響

                     STL (s)

 組　別           電擊前            電擊后24 h

                 中位數    四分位數   中位數     四分位數

NS + NS       24      10 - 35      216      73 - 240

NS +βAP       25      10 - 29     152       15 - 240

D-gal + NS   23       20 - 34     188       55 - 240

D-gal +βAP   33       22 – 77    108^*△   58 - 240

*P < 0. 05 vs NS + NS group. △P < 0. 05 vs D-gal + NS group.

3 　討　　論

有研究報道,對大鼠連續注射D-半乳糖引起擬衰老效應[7 ] ,可導致動物學習記憶能力下降,腦內超氧陰離子自由基水平增高, 超氧化物歧化酶(SOD) 活性降低,丙二醛和脂褐素含量升高. 這說明D-半乳糖誘發的自由基蓄積引起的脂質過氧化損傷,是產生擬衰老變化的原因,這必然也會引起衰老性腦功能的衰退.βAP 是老年性癡呆患者最早出現的典型的病理學特征. 一些學者認為,βAP 可引起學習記憶減退、認知障礙等[8 ] ,是AD 各種病理和臨床表現的始發因素. βAP 具有沉積作用和神經毒性,較高濃度的βAP 能引起神經退化和死亡[1 ] ;βAP 的神經毒性作用可以增強或加大各種傷害性刺激的細胞損傷效應,此外它還具有直接的細胞毒性[9 ] . 但Morimoto報道,在大鼠海馬神經元,單獨注射βAP 不能產生特定的神經毒性作用,僅能引起少量的神經元變性[10 ] . 無論在體外培養細胞,還是在體內研究中,βAP 是否具有神經毒性作用還存在著爭議,其原因可能是所用βAP 的濃度不同所致[11 ] . 本研究結果表明海馬內單獨注射βAP 不能引起明顯的行為學變化,但在衰老動物模型基礎上經βAP 處理后,可導致動物自發活動及學習記憶行為明顯降低,說明D-半乳糖和βAP 有疊加效應. 學習記憶是腦的高級功能,學習記憶減退是腦功能衰退的表現. 因此,本實驗結果提示,在D-半乳糖所致衰老動物基礎上,海馬內注射βAP ,可望作為更接近AD 的一種動物模型. 但它是否具有AD 的各種病理學特征,還有待于做進一步研究。

 

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