【摘要】　目的　探討腦源性神經營養因子(BDN F)、神經生長因子(N GF)對AD 模型鼠腦植入胚基底前腦后
行為改善和移植區胚膽堿能神經元發育生長的影響。　方法　用使君子酸損毀SD 大鼠基底大細胞核制成AD 模
型, 分成BDN F、 N GF、 BDN F+ N GF 及單純移植對照 4 組。在額、頂葉皮質植入同種胚基底前腦細胞懸液, 前 3 組
含相應神經營養因子, 移植后每2d 向側腦室灌注相應神經營養因子共 7 次。移植后1、 215 和4 個月時行避暗回避
試驗和跳臺試驗, 最后腦切片經AChE 組織化學、 ChA T 和LN GFR 免疫組織化學等染色, 對移植區中的神經元及
纖維作定量分析和圖像處理。 　結果　移植后應用神經營養因子的動物較對照組行為改善明顯迅速,BDN F+ N GF
組行為改善又較BDN F 組或N GF 組明顯。形態學證實, 應用神經營養因子動物移植區中AChE 陽性神經元數、
16 900L m2
網格中AChE 陽性纖維交點數及AChE 陽性神經元面積均優于對照組,BDN F+ N GF 組的結果又好于
BDN F 組或N GF 組�！〗Y論　BDN F 與N GF 一樣能促進植入胚基底前腦的AD 模型鼠行為改善和移植區胚膽堿
能神經元的發育生長,BDN F 和N GF 聯合使用比單獨使用一種因子更為有效。
【關鍵詞】　腦源性神經營養因子(BDN F)　神經生長因子(N GF)　胚膽堿能神經元　腦內移植　AD 模型鼠
3 國家自然科學基金資助課題(No. 39170278)
△Department of N eurobio logy,N antongM edical Co llege,N antong　226001, Ch ina
MODULATION OF BDNF AND NGF ON THE DEVELOPM ENT
OF EM BRYONIC CHOL INERGIC NEURONS IN
BRA IN GRAFTS OF AD MODEL RATS
J in Guohua, Xu Huijun , W u Yim ing, Zhong Sh izheng
(D ep artm ent of N eu robiology ,N antong M ed ical Col leg e,N antong;
3
D ep artm ent of A natomy , T he F irstM il itary M ed ical U niversity , Guang z hou)
【Abstract】　Object ive　The effects of BDN F and N GF on the behavioural imp rovement and the development
of embryonic cho linergic neurons of graf ts in AD model ratsw ere studied . Methods　AD model ratsw ere obtained
by inject ions of quisqualic acid into the nucleus basalismagnocellular is . The f rontal and par ietal co r tex ofAD model
rats received the t ransp lantat ion of the same species fetal basal fo rbrain suspensions w ith BDN F,N GF, BDN F +
N GF and w ithout neuro t roph ic facto rs . Mo reover the neuro thoph ic facto rsw ere injected into the cerebral vent r icle
every two days fo r seven t imes . Step2th rough passive avo idance and act ive avo idance testsw ere car r ied at 1, 215 and
4 month s af ter graf t ing . B rain sect ionsw ere stained w ith AChE h istochem ist ry and ChA T o r LN GFR immunoh is2
tochem ist ry . The number of neurons and f ibers in the graf ts w as analysed quant itat ively w ith computer image sys-
tem. Results　The behaviour of animals infused w ith neuro t roph ic facto rs imp roved mo re obviously and quick ly
than the animals infused w ith no neuro t roph ic facto rs . The behavioural imp rovement of BDN F+ N GF group w as
super io r to that of BDN F o r N GF group. Themo rpho logy demo st rated that the number of AChE po sit ive neurons,
3 國家自然科學基金資助課題(No. 39170278)
△Department of N eurobio logy,N antongM edical Co llege,N antong　226001, Ch ina
f ibers’ cro ssing po ints of 16 900L m2
gr id and cell size in graf ts of animals infusedw ith neuro thoph ic facto rsw ere al2
so super io r to that of the animals w ithout neuro t roph ic facto rs, and the data of BDN F + N GF group w ere bet ter
than that of BDN F o r N GF group. Conclus ion　BDN F, as same asN GF, could p romo te the behaviour funct ion and
the development of embryonic cho linergic neurons of graf ts in AD model rats and the combined use of BDN F and
N GF w asmo re effect ive than one k ind mo lecule alone .
【Key words】　BDN F; N GF; Embryonic cho linergic neurons; B rain t ransp lantat ion; AD model rat
　　老年性癡呆(A lzheim er disease,AD )的病理變
化除在大腦皮質出現以B 2淀粉樣蛋白沉淀為主的老
年斑和神經原纖維纏結外, 基底前腦膽堿能神經元
喪失、皮質膽堿能神經纖維支配減少是主要的病理
改變。人們曾嘗試用多種方法治療AD, 但效果均不
理想。有報道用富含膽堿能神經元的胚基底前腦移
植到宿主新皮質或海馬能明顯改善AD 模型鼠的學
習和記憶能力[ 1～ 3 ]
。近年來研究表明, 神經生長因子
nerve grow th facto r,N GF)、腦源性神經營養因子
b rain2 der ived neu ro t roph ic facto r, BDN F ) 對體外
培養的胚膽堿能神經元具有明顯促進成活和分化作
含1 塊胚基底前腦原基的細胞懸液, 按分組要求, 在
懸液中分別加入重組人BDN F (美國Sain t Lou is 大
學徐曉明博士惠贈)和N GF (7s, 寶靈曼公司) , 濃度
為0125gö L , 對照組不加神經營養因子。
AD 模型鼠麻醉固定于立體定位儀, 取左側額、
頂葉皮質為移植點。額葉坐標為A = 117mm , L =
310mm ,V = 212mm (腦膜下) ; 頂葉坐標為A = -
113mm , L = 416mm ,V = 218mm (腦膜下)。每點在
10m in 內用微量進樣器注入 715Ll 細胞懸液, 留針
10m in, 緩慢退針。移植完畢, 將長5mm 帶芯套管插
入同側側腦室, 用聚甲基丙烯酸甲酯將其快速固定
用 , 經側腦室或腦實質應用N GF、 BDN F 亦能保
護基底前腦膽堿能神經元免受隔海馬離斷而致的退
變, 并減輕癡呆程度[ 6, 7 ]
。本實驗將BDN F、 N GF 加
入富含膽堿能神經元的胚基底前腦細胞懸液中, 植
入AD 模型鼠新皮質, 并通過腦室灌注神經營養因
子, 觀察BDN F、 N GF 以及它們聯合使用對AD 模
型鼠腦移植區胚膽堿能神經元發育生長的調控, 為
將神經營養因子與腦移植相結合應用于臨床治療
AD 等神經系統退行性疾病提供實驗和理論依據。
材料和方法
11 AD 模型鼠的制備
220～ 250g SD 大鼠, 性別不拘, 用復合麻醉劑
Ch lo rpen t 經腹腔麻醉(2m lö kg) , 固定于立體定位
儀,參照 Pax ino s 圖譜, 根據基底大細胞核(NBM )
于顱骨, 按分組將用人工腦脊液配制的相應神經營
養因子 4Ll (5gö L )注入側腦室, 1 次ö 2d, 共7 次。于
最后1 次灌注的次日拔管。對照組灌注同量人工腦
脊液。
31 行為測試
測試儀器和方法同施碧濤報道[ 9 ]
。
　311　避暗回避試驗: 在注射QA 后1 周及移植后
1、 215 及 4 個月時進行, 移植后進行時增設正常對
照組(6 只動物) , 記錄試驗第3d 的探索次數和第6d
的滯留時間。
　312　跳臺試驗: 在移植后1、 215 及4 個月避暗回
避試驗結束后進行, 記錄第 7d 的主動及總回避(主
動+ 被動)反應陽性率。
41 形態學檢測
行為測試完畢, 動物麻醉后經升主動脈灌注
的位置, 取左側頭尾 2 個注射點, 每點注射
0114mo lö L 的使君子酸(QA , Sigm a 公司) 015Ll, 速
度 011Llö m in, 留針 5m in。1 周后進行避暗回避試
驗, 若滯留時間小于 300s (正常鼠大于 900s)則為記
憶能力低下, 隨機抽取其中 10%的動物經AChE 組
織化學和ChA T 免疫組織化學染色證實NBM 被損
毀, 則該批鼠確定為AD 模型成功鼠。
21 胚腦移植和神經營養因子的應用
取 24 只AD 模型鼠隨機分成BDN F、 N GF、
BDN F + N GF 和單純移植對照(對照組) 4 組, 每組
6 只。
取 E15～ 17 (頭臀長 12～ 16mm )的同種大鼠胚
基底前腦原基, 根據B jo rk lund
[ 8 ]
的方法制成每 10Ll
100m l 生理鹽水和 400m l 4%多聚甲醛 011mo lö L
PBS (pH714) , 在立體定位儀上取前囟前后 4mm 一
段腦, 后固定 4h, 入 4℃、 20%庶糖 011mo lö L PBS
(pH714)中, 次日行冰凍連續切片, 厚 40L m, 共收集
4 套。第1 套尼氏染色; 第2 套乙酰膽堿酯酶(acetyl2
cho linesterase,AChE)組織化學染色; 從第3、 4 套中
挑選部分有移植區的切片作膽堿乙酰轉移酶(cho line
acetylt ran sferase, ChA T )和低親和力神經生長因子
受體 ( low aff in ity nerve grow th facto r recep to r,
LN GFR)免疫組織化學染色, 一抗為購自寶靈曼公司
的小鼠ChA T 和LN GFR 單克隆抗體, 工作濃度分
別為10m gö L 和5m gö L , 二抗為V ecto r 公司生物素
化的兔抗小鼠 IgG, 1∶200 稀釋, 用ABC 法、 DAB
硫酸鎳銨加強法呈色。 AChE 組織化學染色切片進行
(1) 計數移植區AChE 陽性神經元數; ( 2) 參照
L ew is
[ 10 ]
方法, 在×600 顯微鏡下, 有移植區的切片
隨機抽取 3 個視野, 計數移植區中AChE 陽性纖維
在 16 900L m2
網格中與縱橫線的平均交點數; (3)每
張有移植區的切片隨機抽取 4 只AChE 陽性神經
元, 每只動物共40 個細胞, 用M IA S2300 計算機圖像
處理系統進行細胞面積分析。
51 統計分析
探索次數、滯留時間和AChE 陽性神經元的細
胞數、纖維交點數及面積進行方差分析和 SN K 檢
驗, 各組數據先行方差齊性檢驗, 若方差不齊, 平方
根變換后再行檢驗。主動及總回避反應陽性率進行
V
2
檢驗。
結　　果
　111　避暗回避試驗: 移植前 4 組模型鼠避暗回避
試驗的探索次數和滯留時間方差分析P 均> 0105,
說明4 組模型動物行為無顯著性差異。移植后1 個
月, 各實驗組的探索次數和滯留時間與正常對照組
相比有較大差距; 在4 組實驗動物中, 應用神經營養
因子的 3 組動物與單純移植對照組相比, 探索次數
明顯減少, 滯留時間明顯延長。至215 和4 個月時,
各實驗組的探索次數和滯留時間逐漸接近正常對照
組, 但以BDN F + N GF 組較為明顯, 單純移植對照
組與正常對照組仍有差距; 4 個實驗組的探索次數
進一步減少, 但單純移植對照組在 4 個月時才接近
使用神經營養因子的動物; 滯留時間在應用神經營
養因子的動物進一步延長, 單純移植對照組雖有延
長, 但至 4 個月時與其他組相比仍有差距。移植后
1、 215 和 4 個月時 4 組實驗動物和正常對照組動物
避暗回避試驗和方差分析結果分別見表1, 2。
11 行為測試結果
表 1　移植后1、 215 和 4 個月時 4 組實驗動物和正常對照組動物避暗回避試驗結果(x q)
Table 1　The results of step2th rough passive avo idance test ing in four exper imental group and
no rmal group animals 1 month, 215 and 4 month s af ter graf t ing (x q)
BDN F 組
BDN F group
1 個月 2 . 5 個月 4 個月
N GF 組
N GF group
1 個月 2 . 5 個月 4 個月
BDN G+ N GF 組
BDN G+ N GF group
1 個月 2 . 5 個月 4 個月
對照組
cont ro l group
1 個月 2 . 5 個月 4 個月
正常對照組
no rmal group
1 個月 2 . 5 個月 4 個月
探索次數
acquisit ion f requency
212 118 113 210 115 115 118 113 113 317 218 118 110 018 017
滯留時間(秒)
retent ion t ime ( s)
330 530 800 333 517 760 445 892 1040 146 330 543 930 1020 1137
表 2　移植后1、 215 和 4 個月時 4 組實驗動物和
正常對照組動物避暗回避試驗方差分析結果
Table 2　The results of ANOV fo r step 2th rough passive
avo idance test ing in four exper imental group and no rmal
group animals one month, 215 and 4 month s af ter graf t ing
探索次數
acquisit ion f requency
滯留時間
retent ion t ime
實驗組與正常對照組間的差異仍具顯著性(P <
0105 或 0101)。而在各實驗組中, 移植后 215 個月
時, 探索次數和滯留時間除應用神經營養因子的各
組與單純移植對照組間存在顯著性差異(P < 0105
或 0101)外, 應用神經營養因子的各組滯留時間比
較,BDN F+ N GF 組與BDN F 組或N GF 組間均具
F4125 P F4125 P
1 個月(month s) 10162 < 0101 15182 < 0101
215 個 月
(month s)
7105 < 0101 16189 < 0101
4 個月(month s) 4149 < 0101 8171 < 0101
　　SN K 檢驗結果表明, 移植后 1 個月的探索次數
和滯留時間, 各實驗組與正常對照組之間的差異均
有顯著性(P < 0105 或 0101) ; 在實驗組中, 應用神
經營養因子的各組間無顯著性差異, 而它們與對照
組之間均有顯著性差異(P < 0105 或 0101) ; 移植后
215 個月和 4 個月時, 4 個實驗組的探索次數與正常
對 照組比較, 其差異均有顯著性 (P < 0105 或
0101) ; 滯留時間除BDN F + N GF 組外的其余 3 個
有顯著性差異(P < 0101) ; 移植后 4 個月時, 僅BD2
N F+ N GF 組與單純移植對照組間的滯留時間仍存
在顯著性差異(P < 0101)。
　112　跳臺試驗: 移植后 1 個月, 應用神經營養因
子的 3 組動物主動和總回避反應陽性率均明顯提
高, 而對照組主動回避反應陽性率幾乎為 0, 總回避
反應陽性率也較低。至215 和4 個月時, 應用神經營
養因子的3 組動物主動和總回避反應陽性率均呈較
大幅度增加, 對照組雖有增加, 但幅度較小, 跳臺試
驗第 7d, 主動和總回避反應陽性率結果見表 3。V
2
檢驗結果表明, 移植后 3 個時期, 主動回避反應陽性
率應用神經營養因子的3 組動物間差異均無顯著性
(P > 0105) , 而它們和單純移植對照組間的差異均
有顯著性(P < 0105 或 0101) ; 總回避反應陽性率在
應用神經營養因子的 3 組動物間除移植后 1 個月
BDN F + N GF 組與BDN F 組之間差異有顯著性(P
< 0105) 外, 其余各個時期均無顯著性差異(P >
0105) , 而它們和單純移植對照組間的差異各個時期
均有顯著性(P 均< 0101)。
表 3　4 組實驗動物移植后1、 215 和 4 個月時跳臺試驗第7d 主動和總回避反應陽性率(% )
Table 3　The po sit ive rate of act ive and to tal avo idance react ion in four exper imental group
animals one month, 215 and 4 month s af ter graf t ing (% )
BDN F 組
BDN F group
N GF 組
N GF group
BDN F+ N GF 組
BDN F+ N GF group
對照組
cont ro l group
主動回避
act ive avo idance
2313 3813 4313 2510 3617 4510 3313 4617 5813 011 1313 2313
總回避
to tal avo idance
5813 8510 9313 7313 8313 9117 8813 8813 9313 3010 5617 7117
21 形態學結果
　211　正常NBM 及NBM 損毀后的形態學結果:
尼氏片見正常NBM 區以中到大細胞為主, 組織化
學和免疫組織化學見AChE 和ChA T 陽性細胞呈
梭形或三角形(圖1A )。 QA 損毀后,AChE 或ChA T
陽性神經元基本消失(圖 1B )。正常額、頂葉皮質
AChE 陽性纖維密度較高(圖2A ) ,NBM 損毀后, 皮
質的AChE 陽性纖維終末大部分消失(圖2B)。
　212　移植區形態學結果: 尼氏片見4 組動物移植
區細胞均能存活, 移植區鑲嵌在皮質中。移植區細胞
向宿主遷移的趨勢, 膠質細胞減少, 部分邊界消失
(圖3)。
AChE 組織化學染色片中, 各組移植區AChE
陽性神經元散在或成群分布, 以移植區和宿主交界
處多見; 深染的纖維成網狀或斑片狀, 部分AChE
陽性纖維伸入到宿主皮質, 以應用神經營養因子的
動物較多見。應用神經營養因子的各組和單純移植
對照組比較, AChE 陽性神經元較多, 纖維密度較
高, 面積較大, 應用神經營養因子的各組中又以BD2
N F + N GF 組的結果較好(圖 4～ 6)。4 組實驗動物
成群分布, 以中等大小細胞多見。和單純移植對照組
相比, 可看出應用神經營養因子動物移植區細胞有
移植區AChE 陽性神經元有關統計指標結果見表
4。
表 4　4 組實驗動物移植區AChE 陽性神經元有關指標統計結果(x q±s)
Table 4　The stat ist ical results of AChE po sit ive neurons in graf t areas of four exper imental group animals (x q±s)
BDN F 組
BDN F group
N GF 組
N GF group
BDN F+ N GF 組
BDN F+ N GF group
對照組
cont ro l group
方差分析ANOV
F3120 P
AChE 神經元數
number of AChE neurons
205±31 252±27 295±42 158±28 17120 < 0101
AChE 神經元面積(L m2)
size of AChE neurons (L m2)
1 762±168 1 960±129 2 181±279 1 410±167 16103 < 0101
AChE 纖維交點數
number of AChE f ibers’ cro ssing po ints
60±9 61±8 76±13 44±7 11179 < 0101
　　SN K 檢驗結果顯示,AChE 陽性神經元數各組
間比較, 其差異均有顯著性(P < 0105 或 0101) ,
AChE 陽性神經元面積和AChE 陽性纖維交點數各
組間比較, 除BDN F 組與N GF 組之間無顯著性差
異外, 其余各組間均有顯著性差異(P < 0105 或
0101)。
免疫組織化學染色片, 見移植區中 ChA T 或
LN GFR 陽性神經元大多亦分布在移植物和宿主交
動物移植區中免疫反應陽性神經元生長相對較好
(圖7, 8)。
討　　論
本實驗表明, 應用神經營養因子和單純腦移植
的動物移植后行為均得到改善, 但應用神經營養因
子各組移植后早期即見行為明顯改善, 而對照組到
4 個月時其改善程度仍不及應用神經營養因子的各
界處, LN GFR 和ChA T 陽性神經元數量兩者相比
較,以LN GFR 陽性神經元略多。應用神經營養因子
組, 這與 Sin son
[ 11 ]
在皮質損傷的模型中植入胚 16d
皮質, 用微泵直接灌注N GF 至移植區, 14d 后就發
現記憶缺損和運動功能明顯改善的結果類似。形態
學也證實, 應用神經營養因子動物的移植區中
AChE 陽性神經元數目明顯增多, 胞體面積和纖維
密度也明顯增大, 這與Mou ton
[ 12 ]
將N GF 直接灌注
于AD 模型鼠皮質移植區導致移植物體積明顯增
大、膽堿能神經元增多、纖維密度增加的結果相同。
這些結果的取得可能是由于胚腦細胞懸液中加入神
經營養因子, 能保護因取胚腦、制備懸液時受到損傷
的神經元免于死亡, 并且提供有利于移植物存活的
微環境, 從而提高了胚腦細胞的存活率。加之本研究
在移植后早期, 通過腦室灌注神經營養因子, 使移植
入宿主的胚腦神經元可繼續得到神經營養因子的營
養作用, 亦可保護宿主神經元免受移植而導致的損
害, 表現為膠質反應減輕, 有利于移植物與宿主的整
合。BDN F+ N GF 組行為和形態學結果均較單獨使
用BDN F 或N GF 為好, 這和我們[ 5 ]
在體外培養中
證實BDN F 與N GF 聯合使用對胚膽堿能神經元能
胼胝體　×10
圖2　A 1正常側大腦皮質AChE 陽性纖維; B1QA 損毀側大腦皮質
AChE 陽性纖維減少　×10
圖3　尼氏染色, ↑處示BDN F 組移植區(G)與宿主皮質(H)間界限
已不明顯　×10
圖4　N GF 組移植區中AChE 陽性神經元胞體較大　×100
圖 5　BDN F+ N GF 組移植區中AChE 陽性神經元胞體較大, 突起
豐富　×100
圖6　對照組移植區中AChE 陽性神經元胞體較小、突起較少、較短
　×100
圖 7　LN GFR 免疫組織化學染色, 示BDN F+ N GF 組移植區中的
LN GFR 陽性神經元　×50
圖8　ChA T 免疫組織化學染色, 示N GF 組移植區與宿主交界處的
ChA T 陽性神經元(↑)　×50
Exp lanat ion of f igures
F ig . 1　A: No rmal side ChA T po sit ive neurons in nucleus basalis
magnocellularis; B: ChA T po sit ive neurons disappeared in
QA lesioned side nucleus basalismagnocellularis . A rrow in2
dicated the dest royed areas, C: co rpus callo sum　×10
F ig . 2　A: AChE po sit ive f ibers in no rmal side cerebral co rtex; B:
發揮協同作用的結果相一致, 表明BDN F 和N GF
的協同作用不僅在體外有效, 在體內也產生同樣的
效應。
Mou ton
[ 12 ]
的在體研究表明,N GF 具有明顯促
進移植的胚膽堿能神經元發育生長的作用, 而BD2
N F 對移植的胚膽堿能神經元的作用尚未見報道。
本實驗證實,BDN F 和N GF 一樣, 對移植的胚基底
前腦膽堿能神經元具有明顯提高細胞存活率, 促進
胞體和突起發育生長的作用。
本實驗的移植物是富含膽堿能神經元的胚基底
前腦, 但在移植物中, 作為膽堿能神經元特異性標志
物的ChA T 陽性神經元卻較少。R idley
[ 13 ]
也觀察到
類似結果。究其原因, 可能與體內復雜的微環境影響
了ChA T 的表達有關。而應用神經營養因子的動物
co rtex　×10
F ig . 3　N issl staining, show ing the boundary (↑) between the graf t
(G) and ho st co rtex (H) was no t obvious　×10
F ig . 4　AChE po sit ive neuronsw ith larger cell body in the graf t area
of N GF group　×100
F ig . 5　AChE po sit ive neurons w ith larger cell body and richer p ro2
cesses in the graf t area of BDN F+ N GF group 　×100
F ig . 6　AChE po sit ive neurons w ith smaller cell body, fewer and
sho rter p rocesses in the graf t area of cont ro l group 　×100
F ig . 7　LN GFR immunoh istochem ical staining, show ing LN GFR
po sit ive neurons dist ributed in the graf t area of BDN F +
N GF group　×50
F ig . 8　ChA T immunoh istochem ical staining, ChA T po sit ive neu2
rons (↑) situated in the bo rder between the graf t area and
ho st co rtex　×50
ChA T 免疫組織化學染色結果好于對照組, 可能與
神經營養因子對膽堿能神經元的營養作用及促進
ChA T 的表達不無關系。雖然基底前腦大部分膽堿
能神經元 ChA T 與LN GFR 共存[ 14 ]
, 但新近的研
究[ 15 ]
提示,N GF 和BDN F 對胚膽堿能神經元的營
養作用可能是分別通過它們的高親和力受體 t rkA
和 t rkB 介導而實現的。
收稿1998203　　修回1998209
本文圖1～8 見插圖第3 頁
圖 版 說 明
圖1　A 1正常側基底大細胞核的ChA T 陽性神經元; B1QA 損毀側
基底大細胞核未見ChA T 陽性神經元　↑示QA 注射區; C1
參 考 文 獻
[ 1 ]張之福, 徐慧君, 武義鳴, 等. 胚基底前腦原位移植與靶區移植對
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·研究通訊·
腦膠質瘤基因治療3
田竟生　劉天承　李愛華　孫陽　劉羿男　楊慧
(首都醫科大學神經科學研究所, 北京　100054)
　　腦膠質瘤占顱內腫瘤的40%～ 50%。一般而言, 平均生
存期不超過 1 年�，F有的治療措施如外科手術切除、術后放
療、化療和免疫治療難以達到根除, 復發率很高, 嚴重影響生
存質量和生存期。90 年代由于腫瘤分子生物學理論與技術
DNA 合成, 從而殺傷被 tk 轉染的腫瘤細胞及生產 tk 的細胞
系, 故特稱為自殺基因療法。我們完成了以下 3 方面的研究
內容: (1)含HSV 2tk 目的的基因的4 種質粒和逆轉錄載體的
構建, 包括pCMV 2tk、 pL 22tk、 PEL SN 2tk、 pN 2A 2tk, 經酶切鑒
的發展, 使得基因治療成為醫學研究領域的前沿課題, 為國
內外研究的熱點。
惡性膠質瘤基因治療的策略主要有以下6 類: 11基因置
換; 21 基因補償; 31 基因失活; 41 免疫基因治療; 51 耐藥基
因治療61自殺基因治療。就腦膠質瘤而言, 自殺基因是最佳
選擇。本研究在上述報道的基礎上, 使用單純皰疹病毒胸苷
激酶(herpes simp lex virus thym idine k inases, HSV 2tk)為靶
基因。這是因為 tk 基因表達產物為一種酶, 此酶可使鳥苷類
似物(ganciclovir, GCV )磷酸化, 單磷酸化的GCV 在細胞內
轉化為三磷酸化形式, 摻入分裂細胞的DNA 中, 抑制其
定證明是正向插入; 酶切后的 Southern 雜交顯示均含有
HSV 12tk 序列。(2)將重組HSV 12tk 基因的逆轉錄病毒載體
(pN 2A 2 HSV 12tk)DNA 行體外包裝, 病毒滴度達 5×105
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m l。 (3)通過體外細胞毒實驗和體內人腦膠質瘤裸鼠模型的
實驗性基因治療, 結果表明實驗組與對照組之間差異顯著(P
< 0101)�，F已完成了人腦膠質瘤的實驗性基因治療工作, 為
今后臨床方案的實施提供了基礎資料。
3 北京市自然科學基金資助課題(No. 7951003)
收稿1998212