摘　要: 　

【目的】　探討1 ,6-二磷酸果糖(f ructose21 ,62diphosphate ,FDP) 對大鼠熱性驚厥性學習記憶和情感行為損

害的保護作用。　

【方法】　30 只21 日齡雄性SD 大鼠隨機均分為果糖干預( FDP intervention group ,FD) 、鹽水對照( so-dium chloride solutin cont rol group ,NS) 和熱性驚厥組(febrile seizure group ,FS) 。水浴法建立熱性驚厥模型; FD 組于驚厥前30min 腹腔注射FDP25mg/ 100g 大鼠體重;而NS 組腹腔注射相同體積的0. 9 %氯化鈉溶液; FS 組不予干預。觀察各組在避暗試驗(passive avoidance test , PAT) 、Morris 水迷宮(Morris water maze ,MWM) 及曠場試驗(open field test ,OFT) 中學習記憶和情感行為的變化。　

【結果】　FDP 可使驚厥大鼠在PAT 中的記憶潛伏期延長[ FD 組為(341. 16 ±97. 44) s ,NS 組為(227. 62 ±92. 19) s ,FS 組為(213. 66 ±90. 70) s , P < 0. 01 ] ,錯誤次數(shù)減少( FD 組為1. 84 ±1. 27 ,NS 組為4. 97 ±1. 18 ,FS 組為5. 06 ±1. 38 , P < 0. 01) ;在OFT 中,FDP 可增強反復驚厥大鼠的興奮性( FD 組得分為65. 41 ±8. 02 ,NS組為46. 22 ±7. 97 , FS組為48. 81 ±7. 69 , P < 0 . 01) ,提高大鼠對陌生環(huán)境的適應能力( FD組后肢性站立的次數(shù)為36. 29 ±5. 06 ,NS組為18. 72 ±4. 71 ,FS組為20. 06 ±4. 96 , P < 0. 01) ,改善大鼠的緊張情緒( FD組糞便粒數(shù)為5. 62 ±2. 76 ,NS 組為10. 79 ±2. 91 ,FS 組為11. 43 ±3. 01 , P < 0. 01) ;在MWM 中,FD 組大鼠逃逸潛伏期縮短,搜尋策略改善。　

【結論】　1 ,6-二磷酸果糖可以改善反復驚厥大鼠的學習記憶和情感行為,對驚厥性腦功能損傷具有保護作用。

關鍵詞: 　1 ,6-二磷酸果糖( FDP) ，熱性驚厥，學習記憶，行為，Morris水迷宮

　　熱性驚厥(febrile seizures ,FS) 是兒科常見急癥,有導致不同程度腦損傷的潛在危險。動物實驗證實反復熱性驚厥可導致大鼠學習記憶功能異常和神經元、細胞器及突觸病理結構變化[1～2 ] 。作者采用腹腔預注射1 ,6-二磷酸果糖(f ruc-tose21 ,6-diphosphate ,FDP) 對反復熱性驚厥的幼鼠進行干預,探討FDP 對大鼠熱性驚厥性學習記憶和情感行為損害是否具有保護作用。

1 　對象和方法

1. 1 　對象21日齡雄性SD 大鼠30 只(西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供) ,體質量為(50 ±5) g ;按隨機數(shù)字法均分為果糖干預組( FDP intervention group ,FD) 、鹽水對照組(sodium chloride solution cont rol ,NS) 和熱性驚厥組( FS) ,每組大鼠數(shù)目均為10 只;各組均于標準環(huán)境下飼養(yǎng),自由進食飲水。

1. 2 　方法　

1. 2. 1 　模型建立　采用改良熱水浴法[1 ]建立熱性驚厥大鼠模型。FD 組大鼠每次誘發(fā)熱性驚厥前30 min ,按25 mg/100 g ( 即1ml / 10 0 g) 大鼠體重的劑量向大鼠腹腔內注射2. 5 %的FDP 溶液( FDP 由海南天王國際制藥有限公司提供,批號:20050114) ;而NS 組大鼠腹腔注射相同體積(1 ml/100 g 大鼠體重) 的0. 9 %氯化鈉溶液; FS 組不給予任何干預措施。

1. 2. 2 　避暗試驗(passive avoidance test ,PAT) 　SFK- Ⅰ型避暗測試箱(日本產) 分明、暗兩室,其間有小門相通;避暗習性使大鼠本能地選擇進入暗室,進入暗室的大鼠即刻遭受電擊(3 mA ,50 Hz) 而被動地逃回安全的明室。5 min 不進入暗室則被認為完成了學習,記錄大鼠在完成學習前錯誤地進入暗室的次數(shù),主要反映大鼠近期學習的能力;24 h 后再次放回明室,記錄大鼠由明室進入暗室的時間,即為記憶潛伏期,主要反映大鼠近期記憶的能力。

1. 2. 3 　曠場試驗(open field test ,OFT) 　60 cm ×60 cm ×60 cm 的無頂木盒底部等分為36 個小方格,大鼠放置于中央方格,記錄5 min 內大鼠活動經過的格子數(shù)、后肢性站立的次數(shù)以及排出糞便的粒數(shù)。記分標準為:大鼠1/ 2 以上身體進入相鄰方格記1 分,后肢性站立記1 分,合計為其總分。研究認為,經過的格子數(shù)反映動物的興奮性;后肢性站立的次數(shù)代表大鼠對陌生環(huán)境的適應能力;排出糞便的粒數(shù)提示大鼠的緊張程度[3 ] 。

1. 2. 4 　Morris 水迷宮(Morris water maze ,MWM) 試驗Morris水迷宮由圓形水池(直徑130 cm ,高50 cm) 、攝像頭以及操作分析系統(tǒng)組成。圓形水面被通過圓心的兩條假想垂線劃分為4 個象限。試驗前一天使大鼠在水池內自由游泳2 min ,以熟悉環(huán)境。試驗共4. 5 d ,在一個象限的正中水域內放置一個圓形透明站臺(直徑10 cm ,高28 cm) ,站臺隱于水面下2 cm 處,水溫保持于24 ℃左右。每天上、下午各進行4 次試驗,每只大鼠隨機從每個象限的中點面壁式入水1 次,大鼠入水后盡力逃避水患,當發(fā)現(xiàn)站臺后則棲身其上,圖象采集系統(tǒng)自動記錄大鼠找到站臺的潛伏期。如果120秒仍未找到站臺,由操作者將大鼠引上站臺休息4 秒并將潛伏期記為120 秒。每只大鼠上、下午4 次成績的均值作為一個時段值( Ⅰ2 Ⅸ) 進行分析。大鼠搜尋站臺的策略分為直線式、趨向式、隨機式和邊緣式[1 ] 。從搜尋站臺的效率來看,四種策略的優(yōu)劣次序依次為直線式、趨向式、隨機式、邊緣式。

1. 3 　統(tǒng)計學處理　計量資料以均數(shù)±標準差( . x ±s) 表示。采用SPSS 10. 0 統(tǒng)計軟件依資料性質分別進行方差分析及q 檢驗、χ2 檢驗,MWM 試驗應用自帶軟件進行方差分析,檢驗水準為α= 0. 05 。

2 　結　果

2. 1 　PAT 中學習記憶的變化　FD 組大鼠在達到學會程度時錯誤次數(shù)最少,同NS、FS 組有顯著性差異( q = 6. 63 ,6.29 ; P < 0. 01) 。24 h 后FD 組大鼠的記憶潛伏期最長,同NS、FS 組差異有顯著性( q = 5. 76 ,6. 03 ; P < 0. 01) 。表明FDP 對反復熱性驚厥導致的近期學習記憶受損有保護作用。見表1 。

2. 2 　OFT 中情感行為的改變　FD 組大鼠穿格得分分值最高,后肢性站立的次數(shù)最多,5 min 內排出的糞便粒數(shù)最少;FD 組同NS、FS 組在穿格得分( q = 4. 89 ,4. 63 ; P < 0. 01) 、后肢性站立的次數(shù)( q = 5. 38 ,5. 07 ; P < 0. 01) 以及排出糞便粒數(shù)( q = 5. 81 ,5. 64 ; P < 0. 01) 等方面的差異有顯著性,提示FDP 可以改善反復驚厥導致的大鼠情感行為異常。見表1 。

2. 3 　MWM 試驗中空間學習能力的變化　FD 組大鼠在Morris 水迷宮中尋找隱匿站臺的能力提高,表現(xiàn)為逃逸潛伏期顯著縮短,方差分析表明FD 組同NS、FS 組在逃逸潛伏期方面存在顯著的統(tǒng)計學差異( F = 133. 19 , P < 0. 01) 。見圖1 。

　　FD 組大鼠在Morris 水迷宮試驗中以直線式策略搜尋站臺的頻數(shù)和百分比最高,而以邊緣式策略搜尋站臺的頻數(shù)和百分比最低,說明FD 組搜尋站臺的效率最高。χ2 檢驗表明FD 組同其他兩組在搜尋策略方面存在顯著的統(tǒng)計學差異(χ2 = 50. 51 , P < 0. 005) ; FD 組同FS 組(χ2 = 40. 50 , P <0. 005) 及NS 組(χ2 = 42. 72 , P < 0. 005) 比較也存在顯著的統(tǒng)計學差異,以上結果提示FDP 可以改善反復驚厥導致的大鼠空間學習記憶能力損害。見表2 。

3 　討　論

多項長期隨訪研究發(fā)現(xiàn)FS 和日后情感行為異常、學習困難、智能發(fā)育落后以及顳葉癲癇等有一定的聯(lián)系[4 ,5 ] 。動物實驗證實反復FS 可導致未成熟腦的功能[1 ] (學習記憶和情感行為) 和形態(tài)結構[2 ] (神經元、細胞器) 出現(xiàn)不同程度損傷。FS 腦損傷干預措施的研究已受到關注。本實驗預注射FDP 對反復熱性驚厥的幼鼠進行干預發(fā)現(xiàn), FDP 改善了反復驚厥大鼠的學習記憶和情感行為,提示FDP 對FS 腦功能損傷具有保護作用。

3. 1 　FDP 的臨床應用與作用機制　FDP 是葡萄糖代謝中的一種重要的中間產物,可激活糖酵解中限速酶- 磷酸果糖激酶及丙酮酸激酶活性,加速磷酸烯酮式丙酮酸向丙酮酸轉化,增加細胞內能量,FDP 與細胞膜相互作用改變膜離子通透性,能有效防止平滑肌細胞、神經元、血小板、神經細胞、心肌細胞的“鈣超載”,提高激活Na + 2K+ 泵的活性,防止細胞水腫[6 ] ,具有膜穩(wěn)定、細胞保護、抗氧化及改善氧代謝等作用。FDP 在臨床上已廣泛應用于心肌受損性疾病輔助治療,此外還應用于肝、腎、腦血管等疾病治療和研究[7 ,8 ] 。FDP 的神經保護作用機制主要有[9～11 ] : ①FDP 作為一種高能物質及糖酵解的調節(jié)劑,參與細胞代謝提高腦組織無氧代謝的ATP 生成量; ②提高離子泵能量,抑制Ca2 + 內流,穩(wěn)定細胞內Ca2 + ,維持內環(huán)境穩(wěn)定; ③促進糖無氧酵解,抑制有氧氧化,從而減少氧自由基和有害氨基酸的產生; ④提高紅細胞內2 ,32二磷酸甘油酸含量,穩(wěn)定紅細胞膜,增加缺氧組織對氧的利用。此外, FDP 減少缺氧后大腦早期基因蛋白mRNA 的表達,抑制凋亡和神經元壞死[12 ] ; FDP 還具有改善和調節(jié)細胞的信號通路[13 ]的作用。

3. 2 　FDP 對驚厥性腦損傷的保護作用　反復多次熱性驚厥發(fā)生時,大腦處于缺氧及相對性缺血狀態(tài),對缺氧缺血敏感的海馬部位表現(xiàn)更為明顯。頻繁驚厥所致的缺氧可使線粒體發(fā)生病理變化,出現(xiàn)腫脹甚至空泡樣變,細胞產生ATP不足,致使維持細胞內外離子平衡的各種通道功能受損,尤其是ATP 依賴性的Ca2 + 通道受累,Ca2 + 外流作用受阻而出現(xiàn)反向內流,Ca2 + 內流造成的鈣負載以及由此而激發(fā)的各種興奮性氨基酸及自由基的大量釋放,最終導致神經元變性壞死;興奮性神經遞質應激狀態(tài)下的大量釋放以及缺氧狀態(tài)下神經突觸聯(lián)系功能的減弱,使神經元異常興奮放電增強,又可以促發(fā)驚厥的發(fā)生,形成惡性循環(huán)[2 ] 。FDP 是重要的能源物質,可以通過各種生物膜和血腦屏障而到達中樞神經系統(tǒng)的組織和細胞,提供離子泵活動以及神經元代謝所需的能量,保證正常狀態(tài)下Ca2 + 的外流,阻止Ca2 + 反向內流;促進攜氧紅細胞在缺氧組織釋放氧,增加缺氧局部的氧含量,緩解細胞缺氧狀態(tài);增強紅細胞內二磷酸甘油酸含量,抑制氧自由基和組織胺釋放的作用。推測以上機制的綜合參與使驚厥性神經細胞損傷減輕,學習記憶等腦功能改善。