【摘要 】 目的 采用 HSF1基因敲除小鼠模型探討熱休克因子 1及熱休克蛋白 ( heat shock p r otein,
HSP)在慢性心理應激中對工作記憶的保護作用。方法 將熱休克因子 1 ( heat shock fact or 1)基因野生型
小鼠 (HSF1 + / + )和熱休克因子 1基因敲除小鼠 (HSF12/2 )暴露于 2個月的慢性心理應激 ,部分小鼠在暴
露于心理應激前給予熱休克預處理 , 2個月后采用 T迷宮檢測各組小鼠工作記憶 ,western bl ots檢測和比較
HSP72, HSP25表達 ,采用單因素方差分析和多因素析因設計方差分析對各組小鼠 T迷宮轉換正確數和
HSP72, HSP25表達進行比較。結果 HSF1基因野生型小鼠中 ,慢性心理應激對 T迷宮轉換正確數 (8 . 90
± 0 . 46)次與對照組 (9 . 58 ± 0 . 48)次沒有明顯影響 ( F (1, 65) = 0 . 23, P > 0 . 05) , HSF1基因敲除小鼠中 ,慢
性心理應激引起 T迷宮轉換正確數 (4 . 00 ± 0 . 26)次明顯低于對照組 (7 . 33 ± 0 . 43)次 , F (1, 65) = 32 . 39, P <
0 . 05)。同時野生型小鼠心理應激后海馬組織中 HSP72表達 (1 . 35 ± 0 . 11) , HSP25表達 (1 . 05 ± 0 . 03)明顯
高于 HSF1基因敲除小鼠 ( 0 . 23 ±0 . 03 ) , ( 0 . 26 ±0 . 02 ) ,均 P < 0 . 05 )。熱應激也誘導 HSP72 ( 1 . 71
± 0 . 05) , HSP25 (1 . 33 ± 0 . 05)表達增加 ,明顯高于 HSF1基因敲除小鼠 [ (0 . 26 ± 0 . 03) , (0 . 23 ± 0 . 08) ,均
P < 0 . 05 ] ,但未發現熱應激預處理對 T迷宮轉換正確數有影響 ( F (1, 65) = 0 . 32, P > 0 . 05)。結論 HSF1以
及慢性心理應激誘導的 HSP72, HSP25表達 ,在慢性心理應激中對工作記憶具有保護作用。
【關鍵詞 】 工作記憶; 熱休克蛋白; 熱休克因子 1; 慢性心理應激; T迷宮

長時記憶與工作記憶都與海馬有關。慢性社會心
應激可以損傷海馬 ,引起海馬依賴的長時記憶功能
害[ 1 ]
,但不影響工作記憶[ 2 ]
。急性應激及輕度應激
以引起工作記憶損害[ 3, 4 ]
,其機制與交感神經的激
有關[ 5 ]
。而慢性社會心理應激不引起工作記憶損
害 ,其原因目前尚不清楚。熱休克反應和慢性心理應
激都可以激活 HSF1 ( heat shock fact or1, HSF1) ,誘導
熱休克蛋白 ( heat shock p rotein, HSP)表達增加 ,包括
HSP72、 HSP25,他們在應激中具有重要的抗應激、 保護
細胞、 維持細胞正常結構和功能的作用。而 HSP表達
對心理應激鼠工作記憶是否具有保護意義目前尚不清楚。因此 ,本研究采用 HSF1野生型小鼠和 HSF1基因
敲除小鼠 ,給予慢性心理應激及熱休克預處理 , T迷宮
評定各組小鼠工作記憶 , western bl ots檢測 HSP72、
HSP25表達 ,以探討熱休克預處理及慢性心理應激誘導的 HSP表達在心理應激過程中對工作記憶是否具
有保護作用。
材料與方法
一、 動物與分組
本實驗動物來自美國德克薩斯大學西南醫學實驗
中心培育的 HSF1基因敲除雜合子進行繁殖得來的野
生型小鼠 (基因型為: HSF1 + / + ,簡稱 HSF1 + / +小
鼠 )和 HSF1基因敲除的純合子 (基因型為: HSF12/2 ,
簡稱 HSF12/2 小鼠 ) ,在中南大學湘雅二院動物實驗中
心飼養。全價營養飼料 ,光照 8AM～8PM,室溫 (24 ±
0 . 5) ℃。
6～7月齡小鼠經行為觀察剔除行為表現極端的
小鼠后 ,共選取 65只進入實驗 ,其中 HSF1 + / +小鼠
共 37只 ,隨機分為 4組:對照組 (NS組 ) 12只 ,不給予
實驗應激;心理應激組 ( PS組 ) 10只 ,給予心理應激;
熱休克預處理組 (HS組 ) 6只 ,給予熱休克預處理;熱
休克預處理加心理應激組 (HS + PS組 ) 9只 ,給予熱休
克預處理和心理應激。HSF12/2 小鼠共 28只 ,同樣分
為 NS組 12只 , HS組 6只 , PS組 5只, HS + PS組 5
只 ,分別接受與相對應的 HSF1 + / +小鼠各組同樣處理。實驗過程中死亡的小鼠未記在內。
二、 動物模型制備
1 . 熱休克預處理[ 6 ]
:采用自制的加熱裝置加熱 ,
使小鼠肛溫達 (40 ± 1) ℃,維持約 15min。熱休克預處
理每周 2次 ,于周一和周四給予。
2 . 心理應激:心理應激包括限制應激,高臺應激
和旁觀電擊應激。①限制應激[ 7 ]
:將小鼠置于自制的
不透明塑料小瓶中 (直徑 4 cm,長 8 cm) ,使其無法在
里面自由活動。限制應激每周 2次 ,每次 1 h。②高臺
應激[ 8 ]
:把實驗小鼠放置在一個 10 cm × 10 cm,高1 . 6m
的平臺上 ,平臺放置在光線良好的房間的中央。高臺
應激每周 2次 ,每次 1 h。③旁觀電擊應激:旁觀電擊
應激參照鄒濤等[ 9 ]
的方案進行 ,旁觀電擊每周 2次 ,每
次 1 h,電擊每次持續 5 s,頻率為 1次 /min。
三、 工作記憶評定
根據文獻自制的 T型迷宮[ 10 ]
由兩條等長通道
(75 cm × 12 cm × 20 cm)組成 ,其中豎直部分的末端用
不透明活動門隔出 24cm的通道作為實驗動物的起始
位置。而兩臂的兩端分別作為兩個目標位置 ,在兩臂
的入口分別有兩扇不透明活動門 ,可以對活動門進行開關操作。在迷宮周圍有明顯的視覺參考物。實驗開
始時將實驗小鼠放置在起始位置處 ,打開起始位置的
活動門 ,關上其中一臂入口處的活動門。由于小鼠的
探索天性 ,小鼠會進入迷宮另一臂 ,實驗小鼠探索完回
到起始位置后 ,關上起始位置的活動門 ,讓實驗小鼠在
起始位置內待 5 s,而后把三扇活動門全部打開 ,這時
實驗小鼠能選擇兩臂中的任意一段進行探索 ,當實驗
小鼠進入其中一臂后 ,關上另一臂的活動門。當實驗動物從目標區域回到起始區域后 ,關上起始區域的活
動門 ,讓動物在起始區域中待 5 s。以后重復第二個步
驟 14次。記錄動物每次探索和前一次不同臂的比例 ,
即為 T迷宮正確轉換數。
四、 組織收集
各組動物經在 2個月相應處理 ,行為觀察 12 h后
斷頭處死 ,迅速于冰上剝出海馬 ,液氮中凍存備用。
五、 提取蛋白和 western2 bl ots
取出凍存海馬 ,液氮中研磨成粉,裂解液裂解提取
海馬總蛋白 ,紫外分光光度法定量 ,上樣 ,經 10% SDS 2
聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質 ,轉膜 ,封閉 ,一抗
( anti2 HSP72, anti2 HSP25, stressgen ) 4℃靜置孵育過
夜 ,二抗室溫搖床搖 1 h, DAB顯色 ,全自動圖像分析
系統進行光密度指數分析 , HSP含量以同一張膜上的
HSP含量與 GAPDH含量的比值來表示。
六、 數據分析
數據采用 SPSS12 . 0統計軟件 ,數據采用均數 ±
標誤表示 ,多組比較采用單因素方差分析和多因素析
因設計方差分析 ,兩兩比較采用 t檢驗。結 果
一、 工作記憶功能評定
HSF1基因、 熱休克預處理、 心理應激對小鼠在 T
迷宮轉換正確數的影響見表 1。單因素方差分析結果
顯示:不同基因型、 不同處理組之間 T迷宮轉換正確
數之間有顯著性差異 ( F = 17 . 429, P = 0 . 000)。進一
步做三因素 (HSF1基因、 熱休克預處理、 心理應激 )析
因設計的方差分析 ,結果顯示:對 T迷宮轉換正確數
的影響 , HSF1基因具有主效應 ( F 1, 65 = 64 . 47, P =
0 . 00) ,心理應激具有主效應 ( F 1, 65 = 17 . 61, P =0 . 00) ,而熱應激沒有主效應 ( F 1, 65 = 0 . 32, P =
0 . 57) , HSF1基因與心理應激具有一階交互作用
( F 1, 65 = 14 . 62, P = 0 . 00)。對 HSF1基因與心理應
激的一階交互作用做簡單效應分析 ,發現在 HSF1 - /
-小鼠中 ,心理應激可以引起 T迷宮轉換正確數明顯
減少 ( F 1, 65 = 32 . 39, P = 0 . 00) ,而在 HSF1 + / +小
鼠中心理應激沒有引起 T迷宮轉換正確數明顯減少
( F 1, 65 = 0 . 23, P = 0 . 64)。見表 1。
表 1 T迷宮轉換正確數 (次 , x ±s )
組別 NS PS HS HS + PS
HSF1 + / + 9 . 58 ± 0 . 48
( n = 12)
8 . 90 ± 0 . 46
( n = 10)
9 . 17 ± 0 . 79
( n = 6)
9 . 56 ± 0 . 63
( n = 9)
HSF12/2 7 . 33 ± 0 . 43
( n = 12)
4 . 00 ± 0 . 263
( n = 6)
6 . 60 ± 0 . 40
( n = 5)
3 . 60 ± 0 . 243
( n = 5)
注:與 NS組, HS組比較,
3
P < 0. 05二、 熱休克蛋白表達
1 . HSP72表達:Western印跡分析法檢測海馬內
HSP72的表達 (見圖 1) 。結果顯示 , HSF12/2 各組小
鼠 HSP72表達顯著低于 HSF1 + / +各組小鼠。心理應激引起 HSP72表達在 HSF1 + / +小鼠 ( 1 . 35 ±
0 . 11)中顯著高于 HSF12/2 小鼠 ( 0 . 23 ±0 . 03, P =
0 . 00)。同時 ,熱應激預處理也誘導 HSP72表達在<SPAN style="FONT-FAMILY: 'Verdana'; COLOR: rgb(0,0,0); FONT-SI