【摘要 】 目的 觀察人骨髓基質細胞 (BMSCs)移植對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷 (H I BD)的保護作

用 ,探討 BMSCs腦移植治療 H I BD的可行性。方法 36只新生大鼠隨機分為對照組、 H I BD組和移植組

(均 n = 12)。H I BD組和移植組大鼠 7日齡時結扎左側頸總動脈后吸入 8% 氧氣 2 h制成 H I BD模型。對

照組僅分離左頸總動脈 ,不予結扎和缺氧。分離培養人 BMSCs,損傷后 3 d將 BMSCs立體定位腦移植到移

植組大鼠左側感覺運動皮層。3～4周齡時 ,觀察大鼠行為學和組織學的改變 ,并用免疫熒光檢測移植細胞

的存活情況。結果 缺氧缺血后 3周 , H I BD組海馬 DG區和皮層單位面積內神經元數目較正常組減少 [海

馬 DG區: (39 . 2 ± 5 . 6) 個 vs (51 . 1 ± 3 . 9)個 , P < 0 . 001;皮層: (12 . 3 ± 3 . 0)個 vs (17 . 8 ± 3 . 0)個 , P <

0 . 001 ]。BMSCs移植后海馬 DG區和皮層單位面積內神經元數目 [海馬: ( 44 . 9 ±3 . 1)個 ,皮層: ( 17 . 5 ±

3 . 1)個 ]較 H I BD組增加 ( P < 0 . 01)。與對照組比較 , H I BD組在 T迷宮、 感覺運動功能測試中表現出明顯

的不足。BMSCs腦移植組各項行為學測試成績較 H I BD組均有明顯改善。免疫熒光顯示移植后 3周 ,BM2

SCs在腦內存活。結論 BMSCs腦移植可以改善新生鼠 H I BD。

盡管圍產醫學取得了很大進展 ,缺氧缺血性腦病

(H IE)的發病率并沒有明顯下降 ,它仍是腦癱、 精神發

育遲滯、 學習障礙和癲癇的常見原因[ 1 ]

。雖然目前

H IE的機制研究取得了很大進展 ,但是臨床仍缺少特

異性治療手段 ,以對癥支持綜合治療為主。近來發現

骨髓基質細胞 (BMSCs)移植可以治療成年鼠大腦中

動脈阻斷 (MCAO)模型缺血性腦損傷 , 但 BMSCs移植

治療新生鼠缺氧缺血性腦損傷 (H I BD)是否也有效尚

缺乏相關的研究。新生動物 H I BD屬于彌漫性腦損

傷 ,與成年大鼠 MCAO模型易損部位以及發病和修復機制均有不同。因此我們進行了以下實驗探討BMSCs

移植對新生大鼠 H I BD有無保護作用。

材料與方法

一、 人 BMSCs的原代培養及傳代

取健康胸外傷病人肋骨 (由胸外科提供 ) ,無菌狀

態下 ,用 DMEM完全培養基仔細沖洗骨髓腔 ,將沖洗

下的組織反復通過 1ml的注射器 ,制備成細胞懸液 ,

鏡下計數 ,稀釋后以 1 ×10

7

接種于 75 cm2

培養瓶中。

24 h后換液 ,去除未貼壁的細胞。待貼壁細胞 90%融

合后 , 0 . 25%胰蛋白酶消化傳代。

二、 動物分組及缺氧缺血腦損傷模型的制備

36只新生清潔級 Sp rague2 Dawley大鼠 (由中南大學實驗動物中心提供 ) ,雌雄不拘 ,體質量在 12 g以

上 ,隨機分為對照組 , H I BD組和 BMSCs移植組 ,每組

12只。按照 Rice方法[ 4 ]

制作 H I BD模型。簡述為:分

離、 結扎、 并剪斷左頸總動脈 ,而后將之放入 8%的氮

氧混合氣的 36℃ 恒溫箱 2 h。12只對照組大鼠于 7日

齡行假手術 ,僅予以分離左頸總動脈 ,不予結扎和缺

氧。移植組大鼠在缺氧缺血后 3 d進行移植。

三、 間接免疫熒光

正常山羊血清室溫封閉 30min;加入一抗 4℃冰

箱過夜; PBS洗 5min × 3次;加入二抗室溫 1 h; PBS洗

5min × 3次;熒光顯微鏡下觀察。BMSCs的鑒定所用

一抗分別為小鼠抗 CD11b單抗 (1: 200, Santa Cruz) ;

小鼠抗 CD90 . 1單抗 ( 1: 200, Chemicon) ;兔抗 CD34

多抗 ( 1: 200, Santa Cruz) ;兔抗 CD59多抗 ( 1: 200,

Santa Cruz) ;小鼠抗纖粘連蛋白單抗 ( 1: 200, Santa

Cruz)。體內外人 BMSCs的識別所用一抗為小鼠抗人

核單抗 (1: 30, MAB1281, Chemicon)。二抗為山羊抗

小鼠 I gG2 Cy3 (1: 100, Sigma) ,或山羊抗兔 I gG2 Cy3 (1:

100, Sigma)。

四、 BMSCs移植

取第 5代 BMSCs,洗滌離心后 ,調整活細胞密度為

5 × 10

7

/ ml。應用立體定位儀 ( ST OELTI NG T L 2型 ,

美國 ) ,以左側感覺運動皮層區 (前囟前 0 . 3mm;前囟

左 2mm,深 1 . 5mm)為移植點 ,注入 2μl BMSCs細胞

懸液 (5 × 10

4

/μl)。

五、 行為學測試[ 2 ]

1 . T迷宮測試[ 2 ]

( T maze test) :每只動物每日測

試 5次 ,每次間隔 15min,連續 4 d,共 20次。

2 .感覺運動功能測試: 34日齡時進行測試[ 3 ]

。包

括足錯誤 ,肢體放置和試驗具體方法見鐘樂[ 2 ]

和王

霞[ 3 ]

報道。

六、 組織切片制備

28日齡時進行。10%水合氯醛麻醉 ,打開胸腔 ,

左心室穿刺 ,注入冷滅菌生理鹽水 ,同時剪開右心耳讓

血流出 ,直至流出的液體變清為止 ,再與以 4%多聚甲

醛 /0 . 1MPBS灌注固定。斷頭取腦 ,置于 4%多聚甲

醛 /0 . 1MPBS溶液中固定 72 h以上。常規脫水及石蠟

包埋 ,切片厚 3μm。

七、 尼氏染色

取前囟和前囟后 3mm部位切片 , 0 . 1%甲苯胺蘭

60℃ 溫染 1min,水洗 , 70%、 80%酒精脫水 , 95%酒精

鏡下分化 ,直至細胞核和背景為淡藍或無色, 100%酒

精脫水 ,松節油透明 ,封片。光鏡下 ( × 200)計數皮層

和海馬 DG區單位面積神經元數目。

八、 統計學分析

全部資料用 SPSS11 . 0軟件包統計軟件處理。

結 果

一、 BMSCs的原代培養與傳代剛接種時 ,培養瓶中有大量的懸浮細胞。24 h換

液后可見部分細胞貼壁 ,仍為圓形。骨髓中的造血干

細胞不會貼壁 ,可在換液中逐漸除去。貼壁的細胞漸

增多 ,為成纖維細胞樣細胞 ,胞體細長呈纖維狀 ,細胞

核較大 ,為橢圓形。7 d時 ,細胞呈簇狀生長 ,分布不

均 ,顯示出集落生長趨勢。至 2周時 ,細胞融合成單

層。傳代細胞 24 h內完全貼壁 , 3 d進入對數生長期 ,

7～10 d后即可融合。

二、 免疫熒光

培養的細胞表達 CD59, CD90 . 1和纖粘連蛋白等

抗原 ,不表達 CD11b, CD34等白細胞和造血干細胞抗

原 ,說明其為 BMSCs。小鼠抗人核抗體 (MAB1281)能

識別來源于人的細胞核 ,不識別其他物種的細胞核 ,結

果顯示人 BMSCs表達人核抗體 ,而對照的大鼠 BMSCs不表達人核抗體。

三、 BMSCs移植對缺氧缺血后神經元損傷的影響

缺氧缺血導致了神經元損傷 ,使 H I BD組海馬 DG

區和皮層單位面積內神經元較正常組減少 [ ( 39 . 2 ±

5 . 6)個 vs (51 . 1 ± 3 . 9)個 , P < 0 . 001; (12 . 3 ± 3 . 0)個

vs (17 . 8 ±3 . 0)個 , P < 0 . 001 ]。BMSCs移植后海馬

DG區和皮層單位面積內神經元數目較 H I BD組增加

[ (44 . 9 ±3 . 1)個 , P = 0 . 003; ( 17 . 5 ±3 . 1 )個, P <

0 . 001 ]。

四、 BMSCs移植對缺氧缺血后行為學損傷的影響

1 . T迷宮測試:各組在連續 4 d的試驗中 ,隨著天

數的增加 ,對照組和移植組正確率逐漸增高 ,而 H I BD

組正確率上升不明顯 ,說明學習能力較差。在第 4天

時各組間正確率的差異有顯著性意義 ( F = 24 . 772, P

< 0 . 001) , H I BD組的正確率較對照組和移植組顯著降

低 ( P < 0 . 001, P = 0 . 004) ,移植組的正確率低于對照

組 ( P = 0 . 007)。見表 1。

表 1 各組 T迷宮測試正確率 ( n = 12, % , x ±s )

組別 1 d 2 d 3 d 4 d

對照組 61 . 7 ± 18 . 0 81 . 7 ± 13 . 4 86 . 7 ± 15 . 6 98 . 3 ± 5 . 7

H I BD組 58 . 3 ± 27 . 8 63 . 3 ± 36 . 0 68 . 3 ± 26 . 2 66 . 7 ± 15 . 63 3

移植組 60 . 0 ± 19 . 1 70 . 0 ± 18 . 1 73 . 3 ± 21 . 5 86 . 7 ± 17 . 13 △

F值 0 . 077 1 . 719 2 . 325 24 . 772

P值 0 . 930 0 . 190 0 . 110 0 . 000

注:與對照組比較 3

P› 0. 05,

3 3

P› 0. 01;與 H I BD組比較 △ P›

0. 01

2 .感覺運動測試:足錯誤:各組的足錯誤右左差值

差異有顯著意義 ( F = 15 . 675, P < 0 . 001) , H I BD組右

左差值 (3 . 00 ± 1 . 04)較對照組 (0 . 67 ± 1 . 30)和移植

組 (0 . 33 ± 1 . 44)高 (均 P < 0 . 001) ,說明該組大鼠左

右運動不對稱 ,右側差于左側。移植組與對照組比較

差異沒有顯著意義 ( P = 0 . 525)。

姿勢反射:各組大鼠得分情況見表 2。對照組均

為 0分 ,而 H I BD組僅 8例為 0分 ,兩組差異有顯著意

義 ( Z = - 2 . 145, P = 0 . 032) ;移植組 11例為 0分 ,較表 2 各組大鼠姿勢反射不同得分情況比較 (例數 )

組別 鼠數 0分 1分 2分

對照組 12 12 0 0

H I BD組3

12 8 4 0

移植組 12 11 1 0

注:與對照組比較,

3

P› 0. 05

H I BD組增多 ,但兩組間差異無顯著性 ( Z = - 1 . 476,

P = 0 . 140)。

肢體放置:對照組與移植組大鼠的得分差值絕大

多數為 0分 (百分率分別為 91 . 67%和 100% ) ,而

H I BD組的得分差為 1～4分 (1～4分得分百分率分別為 16 . 67%、 33 . 33%、 16 . 67%、 33 . 33% ) ,與對照組和

移植組比較差異有顯著性 ( Z = - 4 . 349, P < 0 . 001; Z

= - 4 . 4, P < 0 . 001)。

五、 移植后 BMSCs的檢測

單克隆抗人核抗體 (MAB1281)能識別移植到大

鼠腦內的人 BMSCs。在移植部位可見大量陽性細胞

延針道分布 ,大量分布于移植點周圍 ,向腦實質內擴

散 ,隨著移植點距離的增大陽性細胞逐漸減少