摘要 　目的: 探討 NR2B2p ERK 2p Elk21 途徑是否參與了大鼠各學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū) Y 2迷宮逃避性學(xué)習(xí)和記憶。方

法: 健康雄性成年 SD 大鼠 45 只 ,共分為 4 組: ①ifenprodil 腹腔注射組(ifenprodil ip ,14 只) , ②DMSO 腹腔注射組

(DMSO ip ,15只) ; ③ ifenprodil腦室注射組(ifenprodil ic ,8只) ; ④ DMSO腦室注射組(DMSO ic ,8 只) 。以 Y迷宮訓(xùn)

練和測(cè)試成績(jī)作為行為學(xué)評(píng)定指標(biāo) ,用免疫組織化學(xué)和 Western blot 方法觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)p ERK1/ 2 和

p Elk21 的變化。結(jié)果: Ifenprodil ip 組與 DMSO ip 組動(dòng)物的 Y迷宮學(xué)習(xí)成績(jī)沒(méi)有明顯差異( P > 0. 05) ,但 ifenprodil

ip 組 Y迷宮記憶成績(jī)差于 DMSO ip 組( P < 0. 05) 。腹腔注射 ifenprodil 導(dǎo)致 Y迷宮訓(xùn)練后各腦區(qū) p ERK1/ 2 和

p Elk 21 表達(dá)的普遍下降 ,其中以海馬、邊緣區(qū)、杏仁核最為明顯 ,與 DMSO ip 組相比差異有顯著性( P < 0. 05) 。

Ifenprodil ic組與 DMSO ic組第一次 Y迷宮測(cè)試成績(jī)沒(méi)有明顯差異( P > 0. 05) 。第一次測(cè)試后立即腦室給藥并在

給藥后 6 h測(cè)試 Y迷宮記憶再鞏固成績(jī) ,發(fā)現(xiàn)ifenprodil ic組成績(jī)下降 ,與 DMSO ic組相比有明顯差異( P < 0. 05) ,

而且ifenprodil ic組動(dòng)物各腦區(qū)的p ERK1/ 2和p Elk21 表達(dá)與 DMSO ic組相比均普遍下降 ,其中p Elk21 表達(dá)在尾殼

核和邊緣區(qū)幾乎完全消失。結(jié)論: NR2B對(duì)于大鼠 Y迷宮長(zhǎng)期記憶的形成、記憶再鞏固過(guò)程是必要的 ,NR2B 的失

活將破壞這些過(guò)程。同時(shí) NR2B的失活減弱了 Y迷宮訓(xùn)練后及記憶再鞏固測(cè)試后學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)p Elk21 和

p ERK1/ 2表達(dá) ,其中在尾殼核和邊緣區(qū) ,NR2B的失活使記憶再鞏固測(cè)試后p Elk21 表達(dá)完全被阻斷。

關(guān)鍵詞: 　NR2B ; 　 p ERK; 　 p Elk21 ; 　學(xué)習(xí)和記憶; 　信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo); 　大鼠

在神經(jīng)元中 ,胞外信號(hào)反應(yīng)激酶(ext racellular

response kinase ,ERK)途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和神經(jīng)

元可塑性中起重要作用。ERK下游靶目標(biāo)包括突

觸可塑性所必需的轉(zhuǎn)錄因子 CREB ,Elk21 等。神經(jīng)

元中 ERK活性被多條胞外信號(hào)途徑的信號(hào)分子所

調(diào)節(jié)。NMDA 依賴的 ERK蛋白激酶的激活需要包

含有 NR2B 亞基的受體通道的開放和 Ca

2 +

的進(jìn)入。

Ifenprodil 作為一種 NMDA 受體拮抗劑 ,可以

非典型性非競(jìng)爭(zhēng)性地選擇性結(jié)合于NR2B 亞單位的

谷氨酸結(jié)合位點(diǎn) ,從而選擇性地阻斷含有 NR2B 亞

基的 NMDA 受體的作用。NR2B 亞基特異的 NM2

DA受體抑制劑 ifenprodil 以 3μmol/ L 的濃度即可

抑制培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中 60 %的 NMDAR電流 ,同

時(shí)也使 70 % NMDAR 依賴的 ERK 的激活受到抑

制[1 ]

。本實(shí)驗(yàn)即是通過(guò)對(duì)大鼠訓(xùn)練前腹腔注射

ifenprodil 和記憶測(cè)試后腦室注射 ifenprodil 來(lái)觀察

Y迷宮學(xué)習(xí)記憶行為的變化并用免疫組織化學(xué)和

Western blot 方法觀察ifenprodil 對(duì) Y迷宮訓(xùn)練后大

鼠各學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)p ERK1/ 2 和p Elk21 表達(dá) 的

影響 ,以探討 NR2B、 p ERK1/ 2、 p Elk21 信號(hào)通路是

否參與了 Y迷宮行為模式的學(xué)習(xí)記憶及記憶的再鞏固。

1 　材料與方法

1. 1 　動(dòng)物

健康雄性成年 SD大鼠 45 只 ,購(gòu)自第一軍醫(yī)大

學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。體重 200～300 g。保持光照/黑

暗12 h循環(huán)恒定 ,食物由實(shí)驗(yàn)中心提供 ,飲用自來(lái)

水。

1. 2 　實(shí)驗(yàn)分組

動(dòng)物共分為 4 組: ( 1) ifenprodil 腹腔注射組(ifenprodil ip ,14 只) ; (2) ,DMSO 腹腔注射組(DM2

SO ip ,15 只) ,此2 組中分別有7 只動(dòng)物在訓(xùn)練后立

即處死 ,用來(lái)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色; (3) ifenprodil

腦室注射組(ifenprodil ic ,8 只) ; (4) DMSO 腦室注

射組(DMSO ic ,8 只) ,分別在記憶測(cè)試后立即給與

腦室注射。

1. 3 　手術(shù)與給藥

腹腔注射動(dòng)物在訓(xùn)練前 15 min 給藥。將 ifen2

prodil 溶于二甲基亞砜(DMSO)中 ,濃度為 1. 2 mg/ml ,注射量 3 mg/ kg ;DMSO腹腔注射組注射同樣體

積DMSO。

腦室注射組動(dòng)物在第 2 d 記憶測(cè)試后立即經(jīng)腹

腔注射 10 %水合氯醛(0. 4 ml/ 100 g) ,固定于腦立

體定位儀上 ,雙側(cè)腦室鉆孔(坐標(biāo):前囟后 1. 6 mm ,

中線兩側(cè) 2. 0 mm ,深 3. 5 mm) ,將藥物通過(guò)玻璃電

極垂直緩慢注入 ,并留針 10 min。Ifenprodil 溶于

DMSO中 ,濃度為 2. 0μg/μl ,每側(cè)注射 0. 5μl ;DM2

SO腦室注射組注射同樣體積DMSO。

1. 4 　電 Y迷宮中厭暗逃避反射訓(xùn)練電 Y型迷宮三條臂的盡頭均有一燈 ,底部是電

網(wǎng) ,實(shí)驗(yàn)時(shí)其中有一條臂末端的燈發(fā)出亮光 ,此時(shí)該

臂底部電網(wǎng)無(wú)電流通過(guò) ,為安全區(qū);另兩臂末端的燈

不亮 ,底部電網(wǎng)通電(約 50～70 V) ,為非安全區(qū)。

安全區(qū)與非安全區(qū)隨機(jī)改變。每當(dāng)大鼠到達(dá)安全區(qū)

30 s 后再隨機(jī)改變安全區(qū)的位置 ,轉(zhuǎn)變 5 s 后非安

全區(qū)底部電網(wǎng)即有脈沖電流通過(guò) ,刺激正常大鼠足

底而驅(qū)使其跑向安全區(qū)。大鼠在 10 s 內(nèi)從非安全

區(qū)一次性跑向安全區(qū)即被判為正確 ,否則均判為錯(cuò)

誤。第一天訓(xùn)練在每只大鼠上重復(fù) 60 次 ,記錄正確

次數(shù)。少于 25 次視為不合格 ,棄去并及時(shí)補(bǔ)充動(dòng)

物。ifenprodil ip 組及其對(duì)照 DMSO ip 組在訓(xùn)練前15 min腹腔注射。訓(xùn)練結(jié)束 24 h 后(第二天)進(jìn)行

Y迷宮測(cè)試 30 次 ,記錄正確次數(shù)。ifenprodil ic 和

DMSO ic組在 Y迷宮測(cè)試后立即進(jìn)行腦室注射 ,并

在 6 h 后測(cè)試動(dòng)物 Y迷宮記憶的再鞏固。

1. 5 　免疫組織化學(xué)標(biāo)本取材和染色

腹腔注射組動(dòng)物進(jìn)行第二天測(cè)試后立即腹腔內(nèi)

注射 10 %水合氯醛(4 mg/ 100 g)麻醉動(dòng)物。經(jīng)主

動(dòng)脈 4 %多聚甲醛灌注固定。冠狀冰凍切片 ,厚度

35μm。常規(guī)ABC法染色 ,一抗分別為兔抗單克隆

p ERK1/ 2 抗體(1∶ 200 , Cell Signaling Technology 公

司)和兔抗多克隆p Elk21 抗體(1∶ 100 ,Cell Signaling

Technology 公司) 。采用硫酸鎳銨增強(qiáng)的二氨基聯(lián)

苯胺( GDN)法顯色。陰性對(duì)照用正常二抗同源血

清代替一抗 ,其它步驟相同。

1. 6 　數(shù)據(jù)的采集

p Elk21 免疫陽(yáng)性神經(jīng)元使用 scion image 圖像

分析系統(tǒng) ,每只動(dòng)物每個(gè)腦區(qū)選取 5 張切片 ,每張切片選擇一個(gè)代表性視野在 200 倍光鏡下檢測(cè)平均光

密度。每只動(dòng)物所選取切片層面基本相同 ,最后計(jì)

算每組大鼠每個(gè)腦區(qū) p Elk21 免疫陽(yáng)性神經(jīng)元平均

光密度。p ERK1/ 2 免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)在 Olympus顯微鏡 100X 物鏡下進(jìn)行 ,每只動(dòng)物所取切片層面

基本相同 ,數(shù)目相同 ,各腦區(qū)均取 5 張連續(xù)切片 ,獲

得該區(qū)陽(yáng)性神經(jīng)元均數(shù) ,最后計(jì)算每組大鼠每個(gè)腦

區(qū)p ERK1/ 2 免疫陽(yáng)性神經(jīng)元平均數(shù)。

1. 7 　Western blot

腦室注射組記憶再鞏固測(cè)試后立即斷頸取腦 ,

置干冰上分離嗅球、前額葉、尾殼核、邊緣區(qū)、海馬、

小腦組織。低溫勻漿 , 4 ℃, 10 000 ×g 離心 1 h ,

Bradford法測(cè)蛋白濃度 ,變性后 - 80 ℃保存。SDS2

PAGE電泳:8 %分離膠 ,5 %分離膠 ,電泳完畢在半

干電轉(zhuǎn)儀上將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上 ,常規(guī)蛋白

免疫印跡染色 ,一抗分別為兔抗 p ERK1/ 2 抗體(1∶

1 000 ,Cell Signaling Technology 公司)及兔抗 p Elk21 抗體(1∶ 1000 ,Cell Signaling Technology 公司) ,最

后采用硫酸鎳銨增強(qiáng)的二氨基聯(lián)苯胺( GDN)法顯

色。Scion Image圖象處理軟件分析各泳道p ERK1/

2和蛋白條帶光密度(OD)值以及各自的參照泳道

OD值。計(jì)算待檢測(cè)泳道 p ERK1/ 2 和 p Elk21 泳道

與各自相應(yīng)的參照泳道的 OD比值。

1. 8 　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差( … x ±s)表示 ,統(tǒng)計(jì)分

析軟件采用 SPSS13. 0 ,組間分析采用 one2way

ANOVA。2 　結(jié)果

2. 1 　訓(xùn)練前腹腔注射ifenprodil 對(duì)大鼠 Y迷宮學(xué)習(xí)

及 24 h 后 Y迷宮記憶的影響　　

訓(xùn)練前 15 min 腹腔注射 ifenprodil 組動(dòng)物的 Y

迷宮學(xué)習(xí)成績(jī)與 DMSO ip 組相比 ,沒(méi)有明顯差異

( P > 0. 05) ,但是在 24 h 后測(cè)試動(dòng)物的 Y迷宮記

憶 ,ifenprodil ip 組成績(jī)差于 DMSO ip 組成績(jī)<