一.凍存方法:

(1)傳統方法:冷存管置于4C10分鐘-->-20C30分鐘-->-80C 16~ 18小時(或隔夜)-->液氮槽vaporphase長期儲存。

-20C不可超過1小時，以防止胞內冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

(2)程序降溫:利用已設定程序的等速降溫機以-1~-3C/分鐘之速度由室溫降至(-80C以下) -120C，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。

(3)HAKATA無血清細胞凍存： 加入HAKATA無血清細胞凍存液制成懸液，直接凍于-80°C，可保存≥5年。

二. 操作步驟:

(1)冷凍前24-48小時更換半里或全里培養基，使細胞處于指數生長期。

(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):另取一離心管，加入培養基、血清，逐滴加入二甲基亞礬(DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。

(3)離心收集培養之細胞，用加血清的培養基重懸起細胞，取少里細胞懸浮液(約0.1m1)計數細胞濃度及凍前存活率。

(4)取與細胞懸液等里的凍存液，緩慢逐商加入細胞懸液，并晃動試管，制成細胞凍存懸液( DMSO醉后濃度為5~ 10%)，使細胞濃度為1~5x 10*cells/ml，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，1~ 2nl/mal,并取.少里細胞懸浮液作污染檢測。嚴密封口后，注明細胞名稱、代數、日期。然后進行凍存。