細胞培養之秘密花園篇
眾所周知，細胞培養中最常見的組合就是基礎培養基+血清了。隨著科研的深入，無血清細胞培養基應運而生，它添加了血清的主要成分：粘附因子、生長因子、必需的營養物質和激素等，能減少血清帶來的不利因素，使細胞培養的條件更穩定。然而在細胞培養中，常常被大家所忽視的細胞培養輔助試劑也發揮著舉足輕重的作用。今天小編就帶您來探索一下細胞培養的秘密花園——細胞培養輔助試劑。
胰酶是一種蛋白酶，酶切位點是肽鏈的Lys或Arg兩個殘基的羧基端肽鏈，通過在特定位置上降解蛋白，使細胞膜上和培養皿結合處蛋白降解，從而使兩者分離。這時細胞在自身內部細胞骨架的張力以及培養液表面張力的作用下成為球形。
❤ 使用胰酶時需注意哪些細節問題？
在使用胰酶（Trypsins）細胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細菌污染。胰酶細胞消化液消化細胞時間不宜過長，否則細胞鋪板后生長狀況會較差，做流式時的CD Marker也可能會下降。胰酶進行分裝時盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因為冷凍保存時液體體積會膨脹，多次使用同一瓶胰酶反復凍融會降低消化效果并可能造成污染。胰酶適用于消化細胞間質較少的軟組織和傳代細胞，如胚胎、上皮、肝、腎等組織，但對于纖維性組織和較硬的癌組織效果較差。胰酶消化效果主要與pH值、溫度、胰酶濃度、組織塊大小和硬度有關。
注意：不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才表示消化好了。
一般肉眼觀察貼壁細胞層，只要能移動了，多半呈沙狀移動就可以了，這時就應該停止消化。
❤ 如何選擇正確的細胞消化試劑？
BI提供動物來源的傳統胰酶及基因工程生產的重組胰蛋白酶。
動物胰酶普遍用于血清培養，不同的細胞加入胰酶的成分和濃度不一樣。貼壁不牢和半貼壁細胞盡量使用濃度0.05%不含EDTA的胰酶且不需要放在培養箱孵育，這樣易于控制，對細胞的傷害也降到最低。對于難消化的細胞就需要使用含EDTA的0.25%的胰酶，而不是無限地延長消化時間。重組胰酶用于無血清培養。重組胰酶具有與動物源性胰蛋白酶相同的酶學性質，但是不含任何動物源成分，可替代胰蛋白酶使用（常用于細胞治療）。
❤ EDTA和胰蛋白酶各有什么作用呢？
許多人不用胰蛋白酶，只用EDTA，或者用胰蛋白酶/EDTA聯合作用。胰酶切割ECM（負責粘連和附著的蛋白），而EDTA通過螯合Ca2+，抑制Integrin的貼壁活性，所以EDTA的作用更加溫和。
❤ 在細胞培養過程中，抗生素是否是必要的添加物？
答案是否定的，細胞培養時不應常規使用抗生素，因為連續使用抗生素會促進抗生素耐藥性細胞株的產生，導致輕度污染持續存在。一旦將抗生素從培養基中去除，這種輕度污染最終將發展成大規模污染，而且連續使用抗生素還會掩蓋支原體感染及其他隱性污染。另外，有些抗生素會與細胞發生交叉反應，影響細胞生化，并可能改變培養細胞的分化潛能，干擾研究過程。抗生素只能作為對付污染的最后手段而且只能短期使用，并應盡快撤除。如果長期使用抗生素，則應同時進行無抗生素培養，以便作為鑒別隱性感染的對照。
❤ 原代細胞里加雙抗或者三抗，會不會影響細胞生長？
分離原代細胞初期，為了避免造成污染，一般會建議預防性加入適量雙抗或者三抗，適量的抗生素用量對細胞的生長幾乎沒有影響，可以在細胞培養穩定后降低或移除抗生素。
❤ 青霉素（Penicillin）、鏈霉素（Streptomycin）的抑菌原理是什么？
青霉素通過抑制細菌細胞壁四肽側鏈和五肽交連橋的結合而阻礙細胞壁合成并發揮殺菌作用，對革蘭陽性菌有效，但革蘭陰性菌缺乏五肽交連橋，因此青霉素對其作用不大。鏈霉素作用于細菌體內的核糖體，抑制細菌蛋白質合成，對革蘭陰性菌有效。青鏈雙抗 (Penicillin-Streptomycin Solution, Cat#：03-031-1B)聯合抑制細菌，可以有效殺滅G+、G-菌。
❤ 青鏈制真菌素三抗溶液（Penicillin-Streptomycin Nystatin Solution, Cat#：03-032-1B），融解后會有黃色物質析出，屬于正常現象嗎？
三抗本身是濃縮溶液，制真霉素在高濃度飽和狀態水溶性差會被析出呈黃色物質，溶液外觀略顯渾濁，屬于正常現象，可以放心使用。
❤ 如何解決L-谷氨酰胺不穩定的問題呢？
1. 選擇不含谷氨酰胺的培養基，自己添加。
2. 選擇穩定的谷氨酰胺替代物——L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液。
❤ L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的工作原理是什么？
在含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的培養基中培養細胞時，細胞可逐漸釋放氨肽酶，水解二肽，緩慢釋放L-谷氨酰胺和L-丙氨酸至培養基中。隨后，L-谷氨酰胺和L-丙氨酸可被細胞吸收，用于蛋白質生成或TCA循環。這好比是流加培養的策略，將L-谷氨酰胺連續加入培養基中，但是始終維持較低的濃度水平。結果獲得有效的能量代謝和較高的生長量，且不會生成多余的氨。
秘密花園之平衡鹽溶液篇
平衡鹽溶液篇-BI產品推薦
秘密花園之無血清細胞培養添加物篇
秘密花園之胰酶篇
使用胰酶，你必須要注意的事情
❤ 胰酶的作用原理是什么呢？使用胰酶，你必須要注意的事情
胰酶是一種蛋白酶，酶切位點是肽鏈的Lys或Arg兩個殘基的羧基端肽鏈，通過在特定位置上降解蛋白，使細胞膜上和培養皿結合處蛋白降解，從而使兩者分離。這時細胞在自身內部細胞骨架的張力以及培養液表面張力的作用下成為球形。
❤ 使用胰酶時需注意哪些細節問題？
在使用胰酶（Trypsins）細胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細菌污染。胰酶細胞消化液消化細胞時間不宜過長，否則細胞鋪板后生長狀況會較差，做流式時的CD Marker也可能會下降。胰酶進行分裝時盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因為冷凍保存時液體體積會膨脹，多次使用同一瓶胰酶反復凍融會降低消化效果并可能造成污染。胰酶適用于消化細胞間質較少的軟組織和傳代細胞，如胚胎、上皮、肝、腎等組織，但對于纖維性組織和較硬的癌組織效果較差。胰酶消化效果主要與pH值、溫度、胰酶濃度、組織塊大小和硬度有關。
注意：不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才表示消化好了。
一般肉眼觀察貼壁細胞層，只要能移動了，多半呈沙狀移動就可以了，這時就應該停止消化。
❤ 如何選擇正確的細胞消化試劑？
BI提供動物來源的傳統胰酶及基因工程生產的重組胰蛋白酶。
動物胰酶普遍用于血清培養，不同的細胞加入胰酶的成分和濃度不一樣。貼壁不牢和半貼壁細胞盡量使用濃度0.05%不含EDTA的胰酶且不需要放在培養箱孵育，這樣易于控制，對細胞的傷害也降到最低。對于難消化的細胞就需要使用含EDTA的0.25%的胰酶，而不是無限地延長消化時間。重組胰酶用于無血清培養。重組胰酶具有與動物源性胰蛋白酶相同的酶學性質，但是不含任何動物源成分，可替代胰蛋白酶使用（常用于細胞治療）。
❤ EDTA和胰蛋白酶各有什么作用呢？
許多人不用胰蛋白酶，只用EDTA，或者用胰蛋白酶/EDTA聯合作用。胰酶切割ECM（負責粘連和附著的蛋白），而EDTA通過螯合Ca2+，抑制Integrin的貼壁活性，所以EDTA的作用更加溫和。
胰酶篇-BI產品推薦
普通胰酶：
特殊胰酶：
溫馨提示：重組胰酶室溫保存即可噢~
秘密花園之抗生素篇
使用抗生素，你必須要注意的事情
❤ 在細胞培養過程中，抗生素是否是必要的添加物？
答案是否定的，細胞培養時不應常規使用抗生素，因為連續使用抗生素會促進抗生素耐藥性細胞株的產生，導致輕度污染持續存在。一旦將抗生素從培養基中去除，這種輕度污染最終將發展成大規模污染，而且連續使用抗生素還會掩蓋支原體感染及其他隱性污染。另外，有些抗生素會與細胞發生交叉反應，影響細胞生化，并可能改變培養細胞的分化潛能，干擾研究過程。抗生素只能作為對付污染的最后手段而且只能短期使用，并應盡快撤除。如果長期使用抗生素，則應同時進行無抗生素培養，以便作為鑒別隱性感染的對照。
❤ 原代細胞里加雙抗或者三抗，會不會影響細胞生長？
分離原代細胞初期，為了避免造成污染，一般會建議預防性加入適量雙抗或者三抗，適量的抗生素用量對細胞的生長幾乎沒有影響，可以在細胞培養穩定后降低或移除抗生素。
❤ 青霉素（Penicillin）、鏈霉素（Streptomycin）的抑菌原理是什么？
青霉素通過抑制細菌細胞壁四肽側鏈和五肽交連橋的結合而阻礙細胞壁合成并發揮殺菌作用，對革蘭陽性菌有效，但革蘭陰性菌缺乏五肽交連橋，因此青霉素對其作用不大。鏈霉素作用于細菌體內的核糖體，抑制細菌蛋白質合成，對革蘭陰性菌有效。青鏈雙抗 (Penicillin-Streptomycin Solution, Cat#：03-031-1B)聯合抑制細菌，可以有效殺滅G+、G-菌。
❤ 青鏈制真菌素三抗溶液（Penicillin-Streptomycin Nystatin Solution, Cat#：03-032-1B），融解后會有黃色物質析出，屬于正常現象嗎？
三抗本身是濃縮溶液，制真霉素在高濃度飽和狀態水溶性差會被析出呈黃色物質，溶液外觀略顯渾濁，屬于正常現象，可以放心使用。
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秘密花園之細胞凍存液篇
細胞凍存，你必須要注意的事情
❤ 能長期將細胞保存在-20°C / -80°C嗎?
與任何冷凍溶液一樣，在Nutrireez™D10培養基中長期低溫保存在-196°C或液氮中最有效。由于長時間暴露于DMSO中，在-20°C / -80°C中存儲可能會影響細胞活力，而在液氮(-196°C)中保存細胞可以改善這一影響。
❤ 冷凍管應如何解凍？
取出冷凍管后，須立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。
❤ 為什么需要無動物成分(ACF)細胞凍存溶液?
血清是一個“黑匣子”，它包含了許多不需要低溫保存的成分，甚至可能在冷凍和解凍過程中傷害細胞。ACF溶液除了可重復性和一致性外，還能提高活力和回收率。
與任何冷凍溶液一樣，在Nutrireez™D10培養基中長期低溫保存在-196°C或液氮中最有效。由于長時間暴露于DMSO中，在-20°C / -80°C中存儲可能會影響細胞活力，而在液氮(-196°C)中保存細胞可以改善這一影響。
❤ 冷凍管應如何解凍？
取出冷凍管后，須立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。
❤ 為什么需要無動物成分(ACF)細胞凍存溶液?
血清是一個“黑匣子”，它包含了許多不需要低溫保存的成分，甚至可能在冷凍和解凍過程中傷害細胞。ACF溶液除了可重復性和一致性外，還能提高活力和回收率。
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秘密花園之谷氨酰胺篇
❤ L-谷氨酰胺(L-Glutamine)在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?
L-谷氨酰胺是細胞培養中細胞進行能量生成以及蛋白質和核酸合成所必需的一種營養素。L-谷氨酰胺不穩定，在中性溶液中會自發降解，降解率隨保存溫度而變。細胞培養基中的L-谷氨酰胺降解后生成的副產物是氨和焦谷氨酸，而氨對于一些細胞具有毒性（對干細胞，原代細胞的影響尤其大）。
L-谷氨酰胺是細胞培養中細胞進行能量生成以及蛋白質和核酸合成所必需的一種營養素。L-谷氨酰胺不穩定，在中性溶液中會自發降解，降解率隨保存溫度而變。細胞培養基中的L-谷氨酰胺降解后生成的副產物是氨和焦谷氨酸，而氨對于一些細胞具有毒性（對干細胞，原代細胞的影響尤其大）。
❤ 如何解決L-谷氨酰胺不穩定的問題呢？
1. 選擇不含谷氨酰胺的培養基，自己添加。
2. 選擇穩定的谷氨酰胺替代物——L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液。
❤ L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的工作原理是什么？
在含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的培養基中培養細胞時，細胞可逐漸釋放氨肽酶，水解二肽，緩慢釋放L-谷氨酰胺和L-丙氨酸至培養基中。隨后，L-谷氨酰胺和L-丙氨酸可被細胞吸收，用于蛋白質生成或TCA循環。這好比是流加培養的策略，將L-谷氨酰胺連續加入培養基中，但是始終維持較低的濃度水平。結果獲得有效的能量代謝和較高的生長量，且不會生成多余的氨。
△ L-谷氨酰胺以一種可控的方式從培養基輸送到細胞
谷氨酰胺篇-BI產品推薦
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貨號 |
名稱 |
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03-020-1 |
L-Glutamine Solution (200 mM) 谷氨酰胺 |
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03-022-1 |
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) 穩定型谷氨酰胺 |
秘密花園之平衡鹽溶液篇
平衡鹽溶液主要是由無機鹽、葡萄糖組成；它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩定及提供簡單的營養；同時用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。如：HEPES溶液。
❤ HEPES溶液的具體作用？什么時候需要添加HEPES溶液？
HEPES是一種兩性離子有機緩沖液，也用于維持細胞培養基的生理pH值。HEPES廣泛應用于許多生化反應中，并在一些細胞培養基中作為緩沖劑。HEPES對細胞沒有營養價值。當細胞培養需要在CO2培養箱外進行長時間的操作時，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養時需要添加HEPES。神經細胞原代培養的過程中能用到。
❤ HEPES溶液的具體作用？什么時候需要添加HEPES溶液？
HEPES是一種兩性離子有機緩沖液，也用于維持細胞培養基的生理pH值。HEPES廣泛應用于許多生化反應中，并在一些細胞培養基中作為緩沖劑。HEPES對細胞沒有營養價值。當細胞培養需要在CO2培養箱外進行長時間的操作時，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養時需要添加HEPES。神經細胞原代培養的過程中能用到。
平衡鹽溶液篇-BI產品推薦
秘密花園之無血清細胞培養添加物篇
無血清培養基是繼天然培養基，合成培養基之后的第三類培養基。與傳統的培養基相比較，無血清培養基是不含動物血清，但仍可以維持細胞在體外較長時間生長、增殖的一種培養基。大多數細胞在基礎培養基中單獨培養時都不能增殖，它們需要補充額外的生長因子和細胞因子，如激素、轉運蛋白、微量元素或ECM因子。
激素，胰島素作為一種多肽激素，對哺乳動物細胞具有多效合成作用，促進葡萄糖和氨基酸攝取、脂肪生成、單價陽離子和磷酸轉運、蛋白質和核酸合成。轉運蛋白，如轉鐵蛋白，轉鐵蛋白作為鐵的載體，也有助于降低氧自由基和過氧化氫的毒性水平。ECM因子是某些貼壁生長細胞所必需的組分，如纖連蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白等。
激素，胰島素作為一種多肽激素，對哺乳動物細胞具有多效合成作用，促進葡萄糖和氨基酸攝取、脂肪生成、單價陽離子和磷酸轉運、蛋白質和核酸合成。轉運蛋白，如轉鐵蛋白，轉鐵蛋白作為鐵的載體，也有助于降低氧自由基和過氧化氫的毒性水平。ECM因子是某些貼壁生長細胞所必需的組分，如纖連蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白等。
無血清細胞培養添加物-BI產品推薦
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貨號 |
產品 |
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05-750-1 |
人纖維粘連蛋白 |
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41-951-100 |
轉鐵蛋白（不含鐵） |
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41-952-100 |
轉鐵蛋白（鐵離子飽和） |
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41-975-100 |
人類重組胰島素 |
胰島素-轉鐵蛋白-Selenious Acid（ITS）通過補充常見營養物質，可以大幅度降低細胞對胎牛血清的需求。在胎牛血清濃度低于4%的情況下，ITS或ITS-E都能促進各種貼壁細胞的生長。研究表明，下列所述補充成分能被大多數哺乳動物細胞所利用。它們能促進細胞增殖，降低多種細胞對血清的需求。據文獻資料，細胞培養過程中，當ITS或ITS-E與2%-4%的血清一起使用時，可達到與添加10%血清相似的增殖效果。
無血清細胞培養添加物-VivaCell產品推薦
跟著小編探索完細胞培養秘密花園的您，是不是豁然開朗了~
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