引言
單細胞技術的發展為揭開腫瘤的神秘面紗提供了新的手段。運用單細胞技術，能讓我們從腫瘤的哪些角度入手，來解決哪些具體的問題呢？SBC與您分享“Decoding Cancer Biology One Cell at a Time”。

 

對于腫瘤研究來說，可以從基因組不穩定、不受限制的復制潛力、細胞能量調節的失常、織織侵襲和轉移、持續的血管生成、促進腫瘤的炎癥和逃避免疫攻擊等特征進行闡述。雖然大部分的腫瘤包含以上特征，但是，隨著研究的深入，人們越來越認識到，對腫瘤內部的細胞亞群的認知至關重要。比如，腫瘤的不受限復制是由未分化的細胞亞群（腫瘤干細胞）所驅動；侵襲和轉移可能是由上皮-間質轉化（EMT）的激活或者其他侵襲相關的細胞引起；細胞的能量失調及持續的血管生成可能由腫瘤特定區域的，如經歷缺氧和缺乏營養的細胞驅動；而腫瘤免疫逃逸可能也是由特定區域的細胞增強了免疫浸潤引起。因此，對腫瘤亞群的了解有助于腫瘤亞型的識別，特別是在治療或者治療復發過程中的作用。

 

通過治療消除癌細胞，但在隨后出現了復發表明了腫瘤內部客觀的異質性（intratumoral heterogeneity，ITH）存在。傳統的基因組和轉錄組學方法對腫瘤的研究，只能揭示聚集的混合細胞的特征，而掩蓋了ITH，單細胞“組學”的出現，為我們全面描述腫瘤的內部特征鋪平了道路。那么，具體在哪些研究角度和層面，單細胞技術對于腫瘤研究能發揮它的一技之長呢？

 

 

 

 

隨著近年來的技術發展，現在已經能夠實現從基因組，轉錄組，甲基化，染色質可及性，細胞表面/胞內蛋白角度進行單細胞研究。雖然從單個細胞的DNA測序去識別突變信息有一定難度，但是從拷貝數變異（CNA）角度進行分析還是能得到比較可靠和有用的數據。單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）是現有運用的最廣的進行腫瘤ITH研究的工具。通過該方法，既能從功能上，也能從遺傳信息上進行分析。當然，最新的方法，除了常規的基因表達檢測之外，已經能實現融合基因的檢測，也能同時進行DNA和RNA的檢測或者甲基化和轉錄組的檢測。

 

盡管大部分的單細胞轉錄組測序需要新鮮樣本進行實驗，但是，通過對冰凍組織進行提核（snRNA-seq/sNuc-seq）來進行實驗為臨床腫瘤樣本的利用提供了方案。這也將為在臨床情景下，更廣泛地對有時間跨度樣本進行檢測，以對腫瘤發展過程和對治療的療效進行評估提供了可能。

 

 

 

利用單細胞轉錄組測序，能實現細胞亞群的分類，結合對每個類群中上調基因的解讀可以對細胞的類型進行注釋。然而，腫瘤樣本的解讀會面臨挑戰：把惡性細胞（可能由遺傳變異）和非惡性細胞（基質細胞和免疫細胞）進行區分。因此，將基因表達信息和遺傳變異信息的聯合為解決該問題提供了一種可行方案。通常來說，現有的研究通過識別帶有CNAs的細胞來識別惡性細胞，也以此來鑒定惡性細胞中的不同遺傳背景亞型。

 

當然，由于單細胞技術對于基因突變檢出和基因表達檢測的局限，通過對更多基因信息或者結合多個基因的基因集角度來對細胞類型鑒定會更加準確。

 

對腫瘤內的細胞異質性的解讀通常從兩個方面入手：1）不同的細胞分屬于哪些具體的細胞類型；2）每個細胞類型是否能反映出不同的細胞“狀態”。分析細胞周期相關的基因集是常用的對細胞不同狀態進行分類的方法。雖然不夠精確，這種分析還是能對細胞周期激活或者非激活狀態的細胞狀態進行了區分。

 

 

 

 

腫瘤干細胞模型是腫瘤發展進程的基礎，該模型認為腫瘤包含自我更新細胞亞群（某種情況下會引起對治療的抵抗）和其他分化程度更高的細胞類型。利用單細胞轉錄組測序提供的數據，發現了腫瘤發展過程中不同狀態的細胞類型，也發現了腫瘤中的細胞發展過程與正常細胞發育的相似性。

 

比如，在IDH突變的膠質瘤中鑒定到的細胞類型跟神經本身的發育狀態相似。其中有一種神經祖細胞類型（NPC-like），為細胞周期激活細胞，是沿著星形膠質類似（AC-like）或者少突細胞類似（OC-like）世系發展的非增值分化細胞。這種現象同樣在其他的如黑色素瘤，成神經細胞瘤，髓母細胞瘤和多種類型肺癌中發現。這些研究一方面證明了正常發育與腫瘤發展過程的相似性，同樣也說明了腫瘤發展過程與正常分化過程中的差異。

比如，通過單細胞測序，發現了在治療壓力下，可能發生細胞向較早狀態的細胞狀態過渡。用BRAF抑制劑威羅非尼治療后，源自患者的BRAFV600突變的黑素瘤細胞系在治療三天后，顯示向原始神經crest-like表型過渡，其中神經生長因子受體的表達升高，黑素細胞轉錄因子MITF的表達降低。這種向早期發育表型的轉變被認為是耐藥性適應的結果。

 

腫瘤研究的一個重點內容是鑒定不同的疾病亞型以進行針對性的治療。利用普通的腫瘤基因表達數據很難實現這一目標。基于單細胞的分析為腫瘤分類提供了兩方面的重要內容：1.通過單細胞數據得到的亞群來反映傳統分類，這也表明現有分類的基礎也是某類細胞占比；2. 通過描述特定細胞類型的作用及其相互作用，對廣譜大分類的生物學結論提供新的認識。在黑素瘤中，常規認知將腫瘤分類為MITF高或AXL高，但單細胞分析顯示兩種細胞狀態均在單個腫瘤中出現。值得注意的是，AXL高表達腫瘤中也會出現腫瘤相關纖維細胞（CAF）的高表達，說明AXL也會與其他相關的基因同時在腫瘤里表達豐度較高。同樣地，這種現象在結腸癌，頭頸鱗狀細胞癌，卵巢癌中出現。因此，通過單細胞技術，既能發現腫瘤中的特殊惡性細胞，也能找到其他類型的非惡性細胞，這將為腫瘤的再次深入分型提供依據。
 

 

腫瘤微環境（TME）的組成通過復雜的機制影響了腫瘤過程和治療應答。腫瘤微環境細胞包括T細胞，巨噬細胞，內皮細胞和纖維細胞。這些細胞之間的互作溝通是實現生物學功能的基礎。通過單細胞檢測，可以盡可能地了解腫瘤內生態的詳細組成。

 

CD8⁺效應T細胞可以裂解惡性細胞，但是，可能至少有兩個不同的機制會導致其功能減弱：首先，慢性抗原刺激可能導致T細胞衰竭，喪失效應能力；其次，通過一系列復雜的機制，包括與其他TME成分（例如CAF，內皮細胞和巨噬細胞）的相互作用，可以將“浸潤腫瘤的淋巴細胞（TIL）”從腫瘤核心“排除”。單細胞轉錄組測序提供了一種可能，通過剖析TME組成，探究耗竭特異基因的表達特征并確定免疫排斥的潛在機制。此外，通過單細胞免疫組庫分析，還能發現不同的T cell亞克隆。通過對黑色素瘤的單細胞研究，發現了與T細胞活化，與患者腫瘤消退或進展相關的不同CD8⁺T細胞狀態和特征基因，及T細胞被惡性細胞耗竭，預測對免疫檢查點抑制劑治療的反應。

d. 腫瘤微環境和免疫治療應答   

 

腫瘤發生轉移是大多數死亡的重要原因。因此，通過單細胞技術，能為我們從不同的角度增加對轉移的認識：

（1）對促進轉移的細胞狀態的特征了解；

（2）對配對的原位癌和轉移癌組成的了解；

（3）對循環腫瘤細胞（CTC）的分析。

 

EMT是發生轉移的重要特征，雖然帶有一定的爭議。但是，通過對HNSCC的單細胞研究發現，在腫瘤浸潤邊緣發現了EMT-like激活信號，同時是受到CAF調控并在轉移患者中大量存在。其他的研究也得到了相近的結論。因此，針對EMT與轉移的爭論可能在不久的將來會有定論。

 

利用單細胞技術對CTCs細胞的研究，將有助于對轉移早期階段的理解。通過分析乳腺癌CTCs，發現了豐富的CTC亞群，并顯示出顯著的轉移潛力。對CTC亞群的特征分析表明，粘連相關蛋白的基因表達上調，表明細胞轉移能力增強了。

 

通過對配對的原位癌和轉移癌樣本的單細胞檢測，可以鑒定他們之間的遺傳差異，細胞類型組成和細胞階段差別，有利于追蹤轉移過程中的細胞進化過程。結合克隆進化信息，有研究表明，多個克隆共遷移并建立了乳腺癌的浸潤性病變過程。

e. 定向治療的應答 

 

治療應答與微環境中的克隆選擇和細胞適應相關，對惡性和非惡性細胞產生影響。傳統的組織測序很難發現內在的組成，而單細胞測序則不同。對BRAF突變的黑素瘤單細胞測序，在治療前的樣本中鑒定到抗性相關的細胞特征。進一步的體外實驗表明，治療會使這個過程增強，這種情況可能不光是克隆選擇，可能也與藥物誘導的表觀修飾改變有關。在ER + / HER2−乳腺癌中，單細胞測序表明，經過多療程治療后與原發性HER2 +乳腺癌相比，HER2表達增加，對靶向治療的敏感性降低。

 

單細胞組學技術的出現和發展增進了我們對腫瘤異質性，腫瘤進化，腫瘤微環境和治療反應的理解。同時，隨著檢測通量的提高，更多稀有的，具有臨床意義的細胞亞群被發現。單細胞核RNA測序技術的出現為更多已經保存的既有臨床樣本提供了可行檢測方案。單細胞甲基化，染色質可及性檢測的出現豐富了探究細胞不同層面的深度。空間轉錄組的出現為更加深入了解腫瘤微環境中的細胞互作提供了可能。質譜技術的發展也為單細胞層面的蛋白和代謝產物檢測提供了支持。從現有階段來看，單細胞技術運用于腫瘤研究還處于早期階段，隨著研究的深入和技術的進一步發展，將為我們剖析腫瘤和治愈腫瘤提供更多新的見解。

 

 

L Nicolas Gonzalez Castro, Itay Tirosh, Mario L Suvà. Decoding Cancer Biology One Cell at a Time. Cancer Discov. 2021 Apr;11(4):960-970.