10x Genomics 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)自推出以來(lái)，主要針對(duì)各種新鮮冰凍組織。而現(xiàn)在，大家期待已久的FFPE樣品也可以做啦！！！今天，就讓小編帶您了解利用FFPE樣品進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的方法吧。

背 景
結(jié)合了組織學(xué)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和FFPE樣品高通量測(cè)序技術(shù)，Visium Spatial Gene Expression for FFPE 是對(duì)由病理學(xué)專家判斷為主的傳統(tǒng)分析方法的補(bǔ)充。利用該技術(shù)，在人和小鼠的FFPE樣品中，可以在高分辨率水平對(duì)整個(gè)組織切片超過(guò)18000個(gè)基因表達(dá)進(jìn)行分析。通過(guò)對(duì)FFPE組織樣本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，可以檢測(cè)任意通路中的任何基因、解決組織異質(zhì)性并揭示形態(tài)學(xué)背景下空間組織的細(xì)胞類型和狀態(tài)。此外，通過(guò)與免疫熒光技術(shù)（IF）相結(jié)合，可在同一時(shí)間可視化蛋白和基因的表達(dá)信息。

Fig.1 從FFPE樣品中獲得形態(tài)學(xué)背景下高分辨率的基因表達(dá)信息

實(shí)驗(yàn)流程

首先將FFPE組織切片放置在Visium基因表達(dá)芯片上，進(jìn)行組織學(xué)成像（形態(tài)學(xué)背景的H&E染色或使用IF技術(shù)對(duì)蛋白共檢測(cè)）。然后，用RTL探針集在組織中靶向雜交和連接，并用RNase酶處理和透化，與芯片上的捕獲探針結(jié)合延伸。最后，進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序和數(shù)據(jù)分析及可視化。

獨(dú)特的RTL探針設(shè)計(jì)

Visium for FFPE陣列利用RNA模板連接技術(shù)（RTL），首先針對(duì)編碼蛋白轉(zhuǎn)錄組基因設(shè)計(jì)特異性探針對(duì)，然后將探針對(duì)與組織內(nèi)的靶標(biāo)基因進(jìn)行雜交，雜交后探針對(duì)互相連接。隨后進(jìn)行組織透化來(lái)釋放組織中已連接在一起的探針對(duì)，并與芯片上的捕獲探針結(jié)合，從而捕獲到基因的表達(dá)信息。

Fig.2 針對(duì)整個(gè)FFPE組織切片測(cè)序分析的工作流程。A.實(shí)驗(yàn)流程概述。B. RTL探針集捕獲轉(zhuǎn)錄組原理
 

冰凍組織和FFPE組織的Visium空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)果比較

分別使用小鼠腦的新鮮冰凍組織和FFPE組織進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果如下：
 

Fig.3 FFPE與新鮮冰凍組織結(jié)果比較。A.兩種組織結(jié)果測(cè)序飽和度。B.Hpca基因在兩種組織的表達(dá)模式。C.FFPE連續(xù)切片的聚類結(jié)果和檢測(cè)到的總UMI數(shù)。

人乳腺導(dǎo)管癌FFPE樣品中可檢測(cè)到大約18000個(gè)基因

利用Visium Spatial Gene Expression for FFPE技術(shù)，可在人乳腺導(dǎo)管癌原位FFPE樣品中探測(cè)到大約18000個(gè)基因。

Fig.4 覆蓋全FFPE組織樣品中的全轉(zhuǎn)錄組探測(cè)結(jié)果。A.腫瘤FFPE組織切片 H&E染色圖。B. 基因總探測(cè)數(shù)。C.spot分群結(jié)果圖。D.乳腺癌關(guān)鍵基因的空間分布和表達(dá)水平。