《mRNA-LNP疫苗的結構與穩定性》文獻解讀系列三

mRNA疫苗概述

mRNA-LNP 疫苗的組成是其穩定性的基礎。在針對新冠病毒的疫苗開發過程中，已經有多種不同的 mRNA 候選疫苗。目前，有10種不同的針對新冠的mRNA疫苗已進入臨床試驗，包括常規 mRNA疫苗和自擴增 mRNA (SAM)。目前有三種“常規”可編碼完整的S蛋白的mRNA 疫苗已獲批或處于臨床試驗后期。它們是 Moderna 的 mRNA-1273 疫苗、BioNTech/Pfizer 的 BNT162b2/Comirnaty 和 CureVac 的 CVnCoV（可見表1）。

有幾篇綜述對這三種新冠的 mRNA疫苗進行了詳細比較，包括它們在 mRNA 結構和LNP設計方面的差異和相似之處。以下部分旨在概述這些疫苗中mRNA 成分和 LNP遞送系統的功能和特征，因為它們對 mRNA 疫苗的體內給藥和儲存期間的穩定性起著關鍵作用。

表1  有關目前上市使用或臨床 III 期試驗的三種 mRNA-LNP疫苗的信息，出于比較原因，添加了 Onpattro（一種 siRNA-LNP 藥物產品）的藥物產品信息。

* NDA 210922 ONPATTRO (patisiran) 脂質復合物注射液；藥品質量審查附錄（FDA，2017 年）。

a N = 可電離的陽離子脂質（氮），P = 核苷酸（磷酸鹽）。

b推測

2.1 優化mRNA體內穩定性和翻譯能力的mRNA工程

mRNA由于其磷酸基團上帶有負電荷，在生理 pH 范圍內是以聚陰離子大分子的形式存在。遞送mRNA 疫苗的第一個障礙是由于核糖核酸酶在細胞外環境中含量豐富，裸露的mRNA在注射后容易被核糖核酸酶 (RNase) 迅速降解。其次， mRNA進入細胞會被細胞內RNA受體識別，包括內體Toll 樣受體 (TLR) 和細胞質核酸受體。mRNA與這些宿主防御受體的結合會激活先天免疫通路，會導致數百個基因的表達。一方面，這可以為疫苗提供佐劑樣作用。另一方面，它導致細胞處于抗病毒狀態，這強烈降低了細胞內mRNA的穩定性和翻譯表達。攝取進入細胞后， mRNA 鏈需要與核糖體結合以實現所編碼蛋白質的翻譯表達。可以通過mRNA工程顯著改善mRNA 的蛋白質合成速率和功能半衰期，mRNA疫苗中的mRNA鏈的典型元件示意圖如圖1所示。

圖1 體外轉錄 (IVT) mRNA 的結構元件。這些序列中的每一個部分都可以優化和修改，以調節mRNA 的穩定性、翻譯能力和免疫激活能力。

有很多研究嘗試提高mRNA 分子的體內穩定性和翻譯能力，同時避免不需要的先天免疫激活。目前達成共識的是，這可以通過優化 mRNA 的調控區域5' 帽、poly-A 尾和非翻譯區 (UTR)來實現。UTR位于mRNA 編碼區的兩側，可以調節mRNA的穩定性和翻譯。

poly-A尾也能調節mRNA的穩定性，因為它的縮短和去除都會導致 mRNA 的降解。5' 帽結構對于蛋白質生產和翻譯啟動子的結合很重要。此外，具有最大化 GC（鳥嘌呤-胞嘧啶）含量的mRNA 結合密碼子優化，即在編碼區選擇“常用密碼子”，可提高穩定性和翻譯水平。

另一個關鍵因素是mRNA的二級結構，它可以通過密碼子優化和計算工具來改變一級序列使其穩定。通過選擇“高度結構化的編碼序列”在mRNA中構建二級結構 （除了5' UTR 區域）也會產生更高的體內翻譯水平，因為mRNA體內半衰期得到延長。或者，Mauger等人證明天然存在的修飾尿苷的引入，例如使用1-甲基-假尿苷（m1Ψ）代替尿苷，會帶來mRNA二級結構的整體變化，從而達到更高水平的蛋白質表達。

重要的是，目前將RNA結合蛋白對mRNA的胞內識別降至最低的最有效方法是在mRNA中引入這些修飾的尿苷，這些蛋白參與對外來mRNA的先天免疫反應，反過來增強了生物穩定性和翻譯能力，同時降低了mRNA 疫苗的免疫原性。此外，還有跡象表明，m1Ψ 提高了mRNA 的堿基堆積和熔點，從而使mRNA更加穩定。

這可能意味著 Moderna 和 BioNTech/Pfizer 的新冠疫苗，1mΨ的摻入也會提高給藥前mRNA 的穩定性。最近有文章發表了對 CureVac在 CVnCoV mRNA 工程中所做工作的有趣分析，CureVac 采用了不同的策略。然而，即使優化了mRNA的結構，直接注射裸露的mRNA 也不會引起強烈的免疫反應，這可能是因為裸露的mRNA的細胞轉染能力差和對RNA酶（RNase）敏感。這說明僅優化mRNA結構不足以創建有效的 mRNA 疫苗，仍然需要額外的保護和遞送系統。

另一種類型的 mRNA 疫苗SAMs不僅編碼目標抗原，還編碼RNA 聚合酶——來自病毒的“自我放大”因子。通常，SAMs由 9 kb 的mRNA核苷酸組成，而非自我復制的mRNA疫苗的序列長度僅為2-4 kb。開發 SAM 候選疫苗的目的是替代典型的兩劑策略的“啟動-加強”方案，而是達到每位接種者單次注射。由于自帶的復制能力，SAM疫苗的注射劑量低于傳統mRNA疫苗，一劑便可能達到足夠保護效力。

當 SAM 在宿主細胞中被翻譯時，一種RNA聚合酶合成與編碼mRNA 模板互補的反義RNA中間體，再轉錄為許多編碼mRNA 分子，從而使抗原表達延長和增強。目前兩種 SAM 疫苗都編碼完整的S 蛋白，并且這些疫苗在臨床試驗中的最高劑量比常規mRNA 疫苗的典型劑量低十倍以上。臨床開發中的兩種SAM 疫苗是倫敦帝國理工學院的nCoVsaRNA 和 Arcturus/Duke-NUS 的 ARCT-021，兩種疫苗均采用的是LNP包裹技術。