三維細胞培養（Three-dimensional cell culture，3D細胞培養）這個名詞已然成為生物科學領域的熱點。近幾年圍繞“3D細胞培養”公開發表的文章或評論數量上升迅猛，3D細胞培養衍生的類器官技術同樣成為研究學者的利器。2017年，《自然》雜志的子刊《Nature Methods》評價類器官為生命領域的年度技術；2019年，Organoids登上了《科學》雜志的封面，且為類器官特刊。悄然之間，類器官技術出現在各大頂級期刊雜志。2021年，“十四五”重點研發計劃更是把相關腫瘤類器官的研究列為首批重點專項任務。

圖1 3D/2D細胞培養發表文獻數量比較（左圖）；3D細胞培養的市場規模分析（右圖）

 

#3D細胞培養的概念

3D細胞培養是指將動物細胞與具有三維結構的支架材料共同培養，使細胞能夠在三維立體的空間生長、增殖和遷移，構成三維的細胞-細胞或細胞-載體復合物，從而更好地模擬細胞在體內的生長環境。

目前主要分為有支架和無支架的三維培養技術，其中依附支架的材料主要包括膠原和水凝膠等，價格低廉、操作簡單；不依附支架的主要是通過物理方法進行培養，主要包括微載體、磁懸浮、懸滴板等，這類操作復雜、成本投入較大。

圖2 2D培養的人結腸癌細胞（HCT116）；利用VitroGel水凝膠3D培養的HCT116

 

 

#3D細胞培養的最新動態

• 【Stem Cell Res Ther】利用VitroGel水凝膠包裹光活化的脂肪來源的干細胞原位移植改善肥胖小鼠的糖代謝。

• 【Cell Mol Biol Lett】利用VitroGel水凝膠來研究經MSC-CXCL12刺激后的巨噬細胞與腫瘤細胞的共培養。

• 【Cell Stem Cell】利用Matrigel構建人肺泡干細胞培養模型揭示對SARS-CoV-2的感染反應。

• 【Cell】結合先進的3D細胞培養和3D生物打印技術構建體外人體的關節模型。

• 【Nat Commun】自動化微流體平臺助力腫瘤類器官的藥物篩選研究。

 

#3D細胞培養與類器官的聯系

類器官（Organoids）是一種在體外環境下培養而成的具備三維結構的微器官，具有類似于真實器官的復雜結構，并可以部分模擬來源（干細胞、腫瘤組織、病人來源等）組織或器官的生理功能。截至目前已有10多種不同組織、疾病模型及模擬發育的類器官問世。類器官作為一項重大的技術突破，已被公認為生物科學領域研究的重要工具，并具有重要的臨床應用價值。

從類器官的定義和來源來看，是將多能干細胞或患者來源的腫瘤組織等進行3D細胞培養，從而形成相應器官的自組織，并具有自我更新和自我組織的能力，故又稱“平皿里的器官”。綜上，類器官屬于3D細胞培養物，包含器官特異性細胞類型，可以表現出器官的空間組織和復制器官的某些功能。類器官重現了一個生理上高度相關的系統，在三維體系下可以研究復雜的問題。例如，疾病發作、組織再生和器官之間的相互作用。

圖3 利用VitroGel ORGANOID水凝膠進行小鼠腸類器官的培養

 

#如何開展類器官研究

 

01 樣本來源

• 穩定的細胞系：誘導多能干細胞，胚胎干細胞，成體干細胞，永生化細胞系，原代細胞系等；

• 組織類：正常組織，腫瘤組織以及人源異種移植模型等。

 

02 培養體系

• 基礎培養基：DMEM/F12（適合克隆培養）等；

• 常用的生長因子和小分子。

1. Wnt信號通路激活劑：R-Spondin 1，Wnt-3a；

2. 酪氨酸受體激酶的配體，刺激上皮細胞增殖：EGF；

3. TGF-β信號通路抑制劑，抑制上皮細胞分化：Noggin；

4. ROCK抑制劑，保持干細胞多能性：Y-27632。

 

03 3D培養的細胞外基質

• VitroGel水凝膠：無動物源成分的功能性水凝膠，室溫下進行，操作簡單；

• Matrigel/BME等：小鼠肉瘤提取物，成分復雜，操作繁瑣。

 

04 類器官培養與應用的簡易流程圖

圖4 類器官培養流程圖

 

 

#類器官培養方法的比較

類器官的來源廣泛，樣本材料經過不同方法處理后需要在體外進行培養，構建3D培養模型。不同細胞外基質可采用的培養方法也會存在差異，但都可以為類器官體外培養提供生長的微環境。其中VitroGel水凝膠為無動物源成分的功能性水凝膠，室溫下與細胞培養基或含離子成分的溶液混合即可成膠，類器官培養方法多樣；而目前使用較多的Matrigel或其它含動物源成分的基質膠，所有操作或者材料需要在冰上進行，且主要以圓頂（Dome）形式進行類器官培養。現對兩類細胞外基質用于類器官培養的操作方法進行比較：

 

2D包被培養

主要將細胞外基質先鋪板粘附凝固后再將細胞添加在表面，細胞會通過基質表面的孔徑滲入到內部，添加覆蓋培養基后培養形成類器官。

 

 

3D包裹培養

主要將細胞外基質與細胞懸液按一定比例混合，再轉移到培養皿中，待形成軟凝膠或固化后再添加覆蓋培養基進行培養形成類器官。

 

 

液滴式培養

主要利用VitroGel水凝膠的特性進行特有的類器官培養。水凝膠與細胞懸液混合后形成軟凝膠后，仍具有流變性和一定的剪切力，允許以液滴的形式滴加在培養基中培養形成類器官。

 

目前，類器官培養技術正處于技術爆發和科研成果井噴的階段，行業發展具有很大的前景，但挑戰也是并存的。例如，大多數類器官本身不具備血管化的結構；如何在體外模擬腫瘤類器官與免疫細胞相互作用關系；類器官的重復性和一致性；以及類器官下游應用的準確性等。總之，新的技術不斷涌現，助力再生醫學與精準醫療領域的研究更上一層樓。

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參考文獻

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• Zhu L, Feng Z, Shu X, et al. In situ transplantation of adipose-derived stem cells via photoactivation improves glucose metabolism in obese mice. Stem Cell Res Ther. 2021, 12(1): 408. 

• Schuster B, Junkin M, Kashaf SS, et al. Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids. Nat Commun. 2020, 11(1): 5271. 

• Jorgensen C, Simon M. In Vitro Human Joint Models Combining Advanced 3D Cell Culture and Cutting-Edge 3D Bioprinting Technologies. Cells. 2021, 10(3): 596. 

• Youk J, Kim T, Evans KV, et al. Three-Dimensional Human Alveolar Stem Cell Culture Models Reveal Infection Response to SARS-CoV-2. Cell Stem Cell. 2020, ;27(6): 905-919.e10.