細胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）攜帶大量的細胞特異性的生物活性分子，核酸、蛋白質、脂類和糖類等，在機體很多生理病理過程中發揮重要的作用。外泌體可通過傳遞信息影響靶細胞的功能，激活細胞信號通路，在免疫、凝血、腫瘤等生理病理過程中發揮作用。EVs甚至可能通過攜帶聚集蛋白傳播疾病，如神經退行性變疾病。

 

蛋白質的差異表達是區分不同來源外泌體的重要特點，是研究外泌體起源的重要途徑。蛋白質組學已經逐漸成為研究各種亞細胞組分蛋白質組的重要工具。針對外泌體進行蛋白質組學研究，可以揭示疾病發病機制、尋找疾病診斷和預后的生物標志物、篩選疾病治療靶點等。

 

近20年來外泌體蛋白質組學研究發表文章趨勢

（數據來源：PubMed，數據至2021年7月）

 

 

外泌體蛋白質組學技術流程

 
外泌體蛋白質組學應用

外泌體中的蛋白質居多，外泌體蛋白質組學應用廣泛，研究外泌體蛋白質在免疫調節、抗原呈遞、癌癥轉移、腫瘤浸潤、血管生成、神經發育中的生物學功能，標志物的篩選與鑒定、藥物靶點的發現以及功能機制中的作用以及疾病診斷、治療和預后等。

  外泌體蛋白質組學案例分享

案例一：通過定量蛋白質組學鑒定人轉移性黑色素瘤組織細胞外囊泡亞群

 

轉移性黑色素瘤組織酶處理后，差速超速離心分離出不同大小的細胞外囊泡，然后將其進一步分為高密度（HD）和低密度（LD）部分。然后使用電鏡、NTA和TMT定量質譜分析對所有EVs亞種群進行深入分析。

 

TMT定量蛋白質組學結果顯示，大型和小型LD EVs均富集了flotillin-1等幾種蛋白質，ADAM10僅富集在小型LD EVs中，而mitofilin僅富集在大型EVs中。

 

聚類分析結果表明HD EVs 和LD EVs中蛋白表達差異。

 

案例二：外泌體來源ENO1調節整合素α6β4表達促進肝癌生長和轉移

 

α-烯醇化酶（ENO1）在幾種人類惡性腫瘤中被發現失調，包括肝細胞癌（HCC）。

 

文章證明ENO1在HCC細胞或組織中上調，在高轉移性HCC細胞或轉移性組織以及來源于高轉移源的外泌體中表達更高。

 

ENO1表達與肝癌患者的腫瘤淋巴結轉移（TNM）分期、分化程度和不良預后有關。ENO1可以通過外泌體介導在HCC細胞之間轉移，表現出類似于HCC細胞中ENO1過度表達的效果，其通過上調整合素α6β4表達和激活FAK/Src-p38MAPK通路促進ENO1低表達HCC細胞的生長和轉移。

 

 

數據表明，外泌體來源ENO1對于促進肝癌生長、轉移和進一步惡化患者至關重要。這項研究發現了一種新的生物標志物用于臨床評估肝癌進展，特別是預測肝癌轉移風險。

 

通過蛋白質組學分析確定ENO1在LO2exo、HepG2exo、MHCC97Lexo和HCCLM3exo中的表達水平及差異表達。

 

逍鵬生物Dr.Cell 實驗室提供外泌體蛋白質組學服務

#TMT，#DIA，#4D Label Free，#Shotgun

 

✦TMT標記定量蛋白組學

 

TMT (Tandem mass tag)是由ThermoFisher Scientific公司研發的一種多肽體外等重同位素標記的相對與絕對定量技術，采用6、10及16種同位素的標簽，通過特異性標記多肽的氨基基團，經高分辨質譜儀串聯分析，可同時比較多達16種樣品之間的蛋白質表達量，是定量蛋白質組學中經典的高通量篩選技術。

 

實驗流程

 

技術優勢

• 同一批次標記的樣本統一處理，減少人為操作和實驗系統不穩定造成的偏差，實驗平行性較高；

• 同一批次標記定量穩定性高；

• 通過分級方法增加蛋白鑒定深度。

應用領域

• 疾病標志物篩選

• 分子機制研究

• 植物抗逆研究

• 藥物作用靶點研究

• 特殊功能蛋白質篩選

 

✦DIA蛋白質組學

 

DIA（data-independent acquisition，數據非依賴性采集）技術是新一代蛋白質組學分析技術，被Nature Methods雜志評為2015年最值得關注的技術。

 

DIA采用數據非依賴性掃描模式：將質譜整個全掃描范圍分為若干個窗口，然后對每個窗口中的所有離子進行檢測、碎裂，從而無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的信息。從而降低樣本檢測的缺失值，同時提高定量準確性和重復性，實現大樣本隊列中高穩定，高精準的蛋白質組定量分析。 

與DDA（data dependent acquisition，數據依賴性采集）技術相比，DIA技術的優勢包括：

（1）數據采集更完整；

（2）減少采集的隨機性，檢測重現性、穩定性更好；

（3）更能檢測到低豐度信號。

 

DIA與DDA數據采集模式的區別

 

✦Label free 蛋白質組學

 

Label free是一種不依賴于同位素標記的非標記蛋白組定量技術，通過液質聯用技術對蛋白質酶解肽段進行質譜分析，無需使用昂貴的穩定同位素標簽做內標，只需分析大規模鑒定蛋白質時所產生的質譜數據，比較不同樣品中相應肽段的信號強度，從而對肽段對應的蛋白質進行相對定量。

 

TMT、Label Free、DIA如何選擇

 

✦Shotgun

 

Shotgun（鳥槍法）是定性鑒定蛋白質混合物中蛋白質組成最常見、最方便有效的方法。

原理

將樣本中的蛋白質酶解成肽段，經液相色譜分離進入質譜儀后先記錄其一級信號，隨后外加能量將其碎裂后再記錄其二級信號。采用相應的軟件還原樣本中的蛋白質組信息。

 

技術優勢

可全面鑒定復雜混合樣品的大量蛋白質。

 

實驗流程

Dr.Cell實驗室根據研究者的不同需求，提供差異化的蛋白質組學技術服務。

 

Dr.Cell實驗室提供外泌體整體服務方案

關注逍鵬生物公眾號→進入右下角“檢測服務”→輕松下單

 

參考文獻

• Rossella C. et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.Journal of Extracellular Vesicles. 2020,9:1. 

• Keqiu Jiang. et al. Exosome-derived ENO1 regulates integrin α6β4 expression and promotes hepatocellular carcinoma growth and metastasis. Cell Death & Disease. 2020,11:972.