如何在NextSeq™ 500/550和MiniSeq™平臺進行低多樣性文庫測序
若希望低多樣性文庫在NextSeq™ 500/550和MiniSeq™平臺上獲得精確和穩(wěn)定的測序結果，需要精心設計的實驗以及良好的生信分析。低多樣性文庫最常見的例子是基于擴增方法制備的文庫，例如16S宏基因組文庫。這些文庫擴增引物結合的位置，即起始位點的DNA序列基本是相同的。單一的位點會導致堿基組成不平衡，以至于堿基組成從一個循環(huán)到下一個循環(huán)可能會發(fā)生劇烈變化。

NextSeq™ 500/550和MiniSeq™系統(tǒng)使用的是雙通道測序技術。因此，確保每個循環(huán)中均存在4種DNA堿基是非常重要的，這樣分析軟件才能正確鑒定DNA簇并精確讀取堿基序列。低多樣性文庫測序時，為了滿足這種要求，我們建議在設計實驗時，采用以下幾種方法保證每個循環(huán)的多樣性。

利用標簽區(qū)分技術，在測序中加入多個帶有標簽的來自多種應用的樣品, 關于NextSeq™ 500/550和MiniSeq™測序系統(tǒng)上Index混合的指導方針我們會在下面詳細介紹。

· 用多樣性較高應用的帶有標簽的樣品，例如全基因組測序文庫，來增加文庫堿基多樣性

· 為了獲得最佳測序結果，可以利用單標簽或者雙標簽技術，將多個樣品在同一張Flow Cell上進行測序

在測序時摻入全基因組樣品（例如PhiX）

· 可以加入50% PhiX為初始摻入比例，然后根據(jù)一級分析和二級分析的結果，逐步降低PhiX摻入比例。摻入這樣的樣品能提供每個循環(huán)必需的堿基多樣性。

在NextSeq™ 500/550和MiniSeq™平臺原始簇密度最佳范圍如下所示, 而低多樣性文庫在此基礎上須視情況降低上樣量以提升測序質量：

· MiniSeq™試劑原始簇密度最佳范圍為170-220 K/mm2

· NextSeq™ 500/550試劑原始簇密度最佳范圍為170-220 K/mm2

NextSeq™ 500/550和MiniSeq™測序系統(tǒng)Index混合的指導方針

在NextSeq™ 500/550 和MiniSeq™測序系統(tǒng)上對混合文庫進行Index測序時，非常重要的一點是要選擇合適的Index組合，否則可能會因為讀Index時簇定位失敗而導致Index測序失敗。

NextSeq™ 500/550和MiniSeq™為雙通道測序
NextSeq™ 500/550和MiniSeq™測序系統(tǒng)只需要2張圖片就可以區(qū)分4種堿基：一張圖片來自紅光通道，另一張圖片來自綠光通道。不同于每種堿基各帶一種單獨的熒光標記的四通道測序，雙通道測序使用兩種熒光染料，C堿基標記紅色，T堿基標記綠色，A堿基同時標記紅色和綠色，G堿基沒有熒光標記。
 

 

圖1：雙通道SBS熒光成像（假彩色圖片僅是效果圖）為了提高4種DNA堿基的檢測速度，MiniSeq™和NextSeq™ 500/550只用了2個圖像分別捕捉紅色和綠色波段的信號。僅在紅色或綠色圖像檢測到的cluster分別被轉譯為C和T堿基。同時在紅色圖像和綠色圖像被檢測到的cluster被轉譯為A堿基，在兩張圖片中都沒有檢測到信號的cluster將被認為是G堿基。

NextSeq™500/550和MiniSeq™相關Index的考量

Index reads中前兩個循環(huán)必須至少有一個堿基不是G。如果Index read前面兩個堿基都是G，就會由于沒有熒光信號導致cluster定位失敗，所以Index的前兩個循環(huán)中必須有一個堿基有信號才能確保Index的正常拆分。

選擇Index進行組合時，每個循環(huán)都至少有一個通道有信號，最好是兩個通道都有信號。這樣堿基讀取的過程才能確保數(shù)據(jù)分析的精確。

· 紅色通道對應A或者C堿基

· 綠色通道對應A或者T堿基

Index組合的示例

理想的Index組合：每個循環(huán)需要兩個通道都有信號

可接受的Index組合：只有一個通道有信號，但是仍然有足夠的信號進行測序

不好的Index組合：Index read前兩個堿基都是G，沒有信號產(chǎn)生，導致cluster定位失敗。

上述中的這些建議能夠使得NextSeq™ 500/550和MiniSeq™平臺進行低多樣性文庫測序。