本期推送帶來了斯坦福大學的Caleb Lareau博士在去年八月的全球虛擬癌癥研討會上分享的線粒體單細胞ATAC-seq (mtscATAC-seq) 的技術。該技術幫助Lareau博士通過克隆譜系追蹤來評估驅動腫瘤進展、進化和轉移的主要因素——腫瘤克隆異質性。

通過線粒體DNA了解腫瘤發生

“腫瘤形成在時空上是不連續的；是一個通過不同階段不斷推進的動態過程。”^[1]

1958年，英國癌癥研究學院的Leslie Foulds博士提出了上面這樣的觀點，并建立了一種新的腫瘤發生模型。在該模型中，癌癥不像以前推測的那樣以規律的線性方式發展。相反，癌癥起源于更復雜、更分散的路徑^[2]。時間來到20世紀70年代，研究人員又提出了一種由基因組不穩定性驅動的癌癥進展的演化模型，從而導致異質性癌細胞從克隆起源分支出來^[2]。

由基因突變驅動的腫瘤演化標準模型

圖片來源：Darryl Leja, NHGRI

而現在，這種異質性被認為在腫瘤進展、對治療的不同反應和復發中發揮重要作用。根據Caswell和Swanton的說法，“深入了解單個腫瘤的克隆復雜性及其對腫瘤進展、免疫逃逸和衰竭的貢獻，可能對開發更有效的癌癥治療方法至關重要”^[2]。

但是，當變化的特征難以識別時，理解驅動腫瘤進展的細胞間變化就十分具有挑戰了。研究人員利用基因突變來跟蹤從最初的克隆到腫瘤生成的路徑，包括拷貝數變異 (CNVs) 和單核苷酸變異 (SNVs) 。然而，Lareau博士在全球虛擬癌癥研討會上指出，這種方法在處理沒有大量可檢測的CNVs或SNVs的腫瘤時會失效。也正是這一挑戰促使他的團隊尋求其他方法來解構克隆譜系并揭示了腫瘤中的混合細胞群。

研究人員將體細胞線粒體DNA (mtDNA) 作為追蹤腫瘤細胞克隆譜系的有效生物學參數。mtDNA在細胞分裂的每個周期中被傳遞給子細胞，并且被嚴重誘變，突變率是核基因組的10到100倍。因為每個細胞中有成百上千個mtDNA拷貝，所以確定的突變具有很高的可信度。這使得mtDNA在追蹤細胞系中的體細胞突變方面非常具有價值。并且從實驗的角度來看，mtDNA也很容易獲得。此外，由于每個分子比核基因組小20萬倍，對mtDNA進行測序的成本也不高。

Lareau博士還指出了使用mtDNA的另一個關鍵優勢：它可以通過標準的染色質可及性實驗方案進行測量。

“在ATAC-seq中，多達一半的讀取將歸因于線粒體DNA。這是因為線粒體DNA沒有核小體或組蛋白，所以整個16.6kb的重疊群本質上是存在于細胞質中，在線粒體中，Tn5[轉座酶]可以對其進行切割。這通常被認為是ATAC-seq中令人討厭的一部分，但對于對測序線粒體DNA以創造深度感興趣的人來說，這卻是一個兩全其美的方法，使用標準的ATAC-seq可以對線粒體DNA和可及性染色質進行非常深入的測序，實現細胞突變的評估以及推斷細胞狀態的特性。”

Lareau博士解釋說，憑借進行深度線粒體測序的能力，甚至可以檢測到低頻體細胞突變，這可能揭示克隆進化的隱藏驅動因素或導致異質性的少量不同腫瘤細胞。

單細胞ATAC-seq的樣本準備

因為在談到腫瘤異質性時每個細胞都很重要，所以線粒體DNA的單細胞視圖對于Lareau博士的實驗至關重要。因此他的團隊選擇進行10x Genomics Chromium Single Cell ATAC-seq測定，然而ATAC-seq需要單核作為樣本輸入，這意味著線粒體的丟失。

于是Lareau博士接下來的一個挑戰就是開發一種方法，從而可以在基于液滴的單細胞ATAC-seq反應中保留細胞質及其內容物。樣品制備和數據處理中的三項關鍵創新實現了這一設想。他們采用了一種改良的細胞裂解方案以保留mtDNA，增加了一個額外的固定步驟，并開發了一個新的計算框架來調用變體，包括頻率較低的變體。這些創新實現了在單細胞分辨率下對整個線粒體染色體的幾乎無偏的覆蓋，從而獲得更高的細胞通量和性能。

線粒體DNA --圖片來源：NHGRI

當應用于慢性淋巴細胞白血病樣本時，這種方法的優勢也很明顯。白血病患者外周血中的B細胞數量較多，這些B細胞通常共享一個主要的B細胞受體 (BCR) 序列。這是克隆擴張的標志，意味著組成腫瘤的大多數B細胞都是設定受體序列的初始克隆的子細胞。然而，Lareau博士想知道是否能在這些看似同質的B細胞中找到獨特的亞克隆群。

對于一半的白血病樣本，他們使用10xGenomics的5'單細胞RNA測序技術來測量單個細胞的基因表達和BCR序列。對于剩下的一半樣本，他們利用改良的mtscATAC-seq實驗方案來識別亞克隆線粒體DNA突變。特別是有一名患者，有十幾個體細胞突變，使他們能夠將B細胞聚集成9個獨特的亞克隆。

“在發現這些突變后，我們有點想知道，這些被這些突變標記的腫瘤細胞是否有任何功能價值？”

仔細觀察他們對BCR序列和mtDNA突變進行測序的一組細胞，他們改進了潛在的亞克隆群體。雖然一些攜帶線粒體突變的亞克隆與大多數腫瘤具有相同的BCR序列，但一小群B細胞在14858G等位基因處共享一個突變并具有不同的BCR序列。

“這提供了一些全面的佐證，即DNA突變正在標記某種真正的、功能性的亞克隆，該亞克隆與腫瘤的其余部分具有非常不同的BCR序列。”

mtscATAC-seq解鎖更大的多組學潛力

mtscATAC-seq提供了定義腫瘤中獨特亞克隆的潛在生物學的高分辨率視圖，通過解鎖隱藏的腫瘤異質性，mtscac-seq有可能幫助科學家建立更全面的癌癥知識。而這僅僅是個開始。新一代多組學的持續創新，即從同一單個細胞或組織切片同時捕獲多個測量值，正在打開新的大門，使得科學家在同一實驗中能夠獲得更多的分析數據。Lareau博士和該領域的其他領軍人物，前紐約基因組中心的Eleni Mimitou和Peter Smibert共同開發了ASAP-seq（ATAC 與 Select Antigen Profiling bySequencing）。利用mtscATAC-seq所展示的方法改良，即增加額外的細胞固定步驟以保持蛋白質表達，ASAP-seq使科學家能夠“收集染色質可及性、數百種細胞表面和細胞內蛋白質的豐度以及數千種細胞的mtDNA變體的信息。”^[3]。不久之后，該團隊還開發了DOGMA-seq，它利用來自10x Genomics的Chromium Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression從同一細胞中捕獲更多信息層，即RNA。

參考文獻：

[1]Foulds L. The natural history of cancer. J Chronic Dis 8: 2–37 (1958).

[2]Caswell DR and Swanton C. The role of tumour heterogeneity and clonal cooperativity in metastasis, immune evasion and clinical outcome. BMC Med 15: 133 (2017).

[3]Tang L, et al. Arsenal of single-cell multi-omics methods expanded. Nat Methods 18: 858 (2021).