活體顯微成像（IVM）和光學(xué)相干斷層掃描（OCT）是兩種強(qiáng)大的光學(xué)成像工具，能夠在活體動(dòng)物中，觀察亞細(xì)胞水平的動(dòng)態(tài)活動(dòng)。結(jié)合標(biāo)記和無標(biāo)記技術(shù)的，IVM和OCT在臨床前和臨床癌癥成像方面得到非常廣泛的應(yīng)用，包括腫瘤的解剖學(xué)、生理學(xué)、腫瘤內(nèi)細(xì)胞遷移和腫瘤的分子學(xué)動(dòng)力。這些應(yīng)用對(duì)闡明癌癥生物機(jī)制、研究腫瘤的復(fù)雜生理、細(xì)胞和分子行為起到了極大幫助。同時(shí)IVM和OCT技術(shù)也在不斷發(fā)展進(jìn)步以適用于更多領(lǐng)域。如非線性光學(xué)顯微鏡技術(shù)的發(fā)展使得能用無標(biāo)簽的IVM對(duì)癌癥胞外基質(zhì)進(jìn)行成像。新的光學(xué)設(shè)計(jì)和算法推動(dòng)了無標(biāo)簽的OCT技術(shù)的發(fā)展，使得OCT能夠能精確的檢測(cè)腫瘤邊緣和脈管系統(tǒng)。同時(shí)熒光標(biāo)簽技術(shù)促使IVM可用于追蹤腫瘤干細(xì)胞、觀察腫瘤進(jìn)展中腫瘤內(nèi)遺傳多樣性、追蹤治療過程中各種免疫細(xì)胞的遷移。OCT造影劑提高了OCT的靈敏度，使其能夠?qū)δ[瘤及其周圍的生理、分子表達(dá)、細(xì)胞行為進(jìn)行成像。此外在雙模內(nèi)窺鏡中結(jié)合使用IVM和OCT，使得我們能夠?qū)σ恍┣粌?nèi)位置進(jìn)行更有效更徹底的癌癥篩查，如胃腸道和膀胱，本文意在闡明每種成像技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，重點(diǎn)關(guān)注過去5年來IVM和OCT在活體癌癥成像領(lǐng)域的重要進(jìn)展、關(guān)鍵技術(shù)的發(fā)展以及在基礎(chǔ)癌癥生物學(xué)研究和臨床腫瘤學(xué)研究中的新興應(yīng)用。這些技術(shù)在解剖、生理、細(xì)胞和分子研究角度的成像應(yīng)用，幫助我們極大提高了對(duì)癌癥生物學(xué)的理解，為臨床前和臨床管理提供了更多思路。   

高分辨率體內(nèi)癌癥成像技術(shù)
 影像學(xué)是腫瘤臨床管理和臨床前研究不可或缺的工具。磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）和超聲等臨床成像技術(shù)能夠?qū)Π┌Y的位置、解剖結(jié)構(gòu)及其隨時(shí)間的變化情況進(jìn)行宏觀測(cè)量，但無法測(cè)量病變的細(xì)胞和分子尺度細(xì)節(jié)�；铙w顯微（intravital microscopy, IVM）和光學(xué)相干斷層掃描（optical coherency tomography, OCT）采用不同的成像機(jī)制，能達(dá)到亞細(xì)胞尺度的分辨率，促進(jìn)臨床和臨床前的廣泛研究（圖1 ）。
    圖1. IVM、OCT和標(biāo)準(zhǔn)臨床成像模式間，空間分辨率與成像深度的對(duì)比示意圖。

IVM依賴單光子或多光子熒光顯微鏡（multiphoton fluorescent microscopy, MPM）對(duì)活體組織進(jìn)行掃描，可以在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行急性觀察，也可以在幾天到幾個(gè)月內(nèi)對(duì)組織位點(diǎn)進(jìn)行長期觀察。OCT采用雙光束干涉來捕捉通過組織的光散射模式。結(jié)合先進(jìn)的熒光標(biāo)簽技術(shù)，IVM可用于臨床前癌癥生物學(xué)研究中，實(shí)時(shí)表征復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME），包括跟蹤腫瘤進(jìn)展、跟蹤腫瘤脈管系統(tǒng)生長和退化、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、腫瘤干細(xì)胞的增殖、腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞的遷移、癌癥治療因子與癌癥和免疫細(xì)胞之間的相互作用等等。非線性光學(xué)顯微鏡的發(fā)展使得IVM不用熒光標(biāo)簽就能夠觀測(cè)到腫瘤的細(xì)胞外基質(zhì)。與臨床前癌癥研究中的應(yīng)用相比，IVM在臨床中應(yīng)用沒那么普遍，主要集中在胃腸癌內(nèi)鏡評(píng)估和膀胱腫瘤的膀胱鏡評(píng)估。OCT常用來非侵襲性地表征淺表皮膚癌和腔內(nèi)腫瘤的解剖結(jié)構(gòu)。與IVM相比OCT的組織滲透性更好、視野更寬、成像速度更快（表1），是臨床腫瘤研究的有力工具，如可探測(cè)腫瘤邊緣作為術(shù)中手術(shù)指導(dǎo)。結(jié)合最近出現(xiàn)的造影劑，OCT技術(shù)極大擴(kuò)展了其對(duì)癌癥細(xì)胞和分子的成像能力，對(duì)腫瘤相關(guān)白細(xì)胞的實(shí)時(shí)跟蹤，對(duì)過表達(dá)的癌癥生物標(biāo)記分子成像等。使用IVM和OCT進(jìn)行臨床前癌癥成像研究可以幫助我們更深入探究一些基本的癌癥生物學(xué)問題。如Karagiannis等利用IVM研究了化療后常駐巨噬細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)化療會(huì)增加巨噬細(xì)胞促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的速度。SoRelle等使用OCT發(fā)現(xiàn)金納米顆粒造影后可以繪制出多性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的遷移軌跡。臨床上結(jié)合使用IVM和OCT能夠更有效更準(zhǔn)確的進(jìn)行癌癥篩查，也能夠更好的表征腫瘤病變的形態(tài)學(xué)和分子特征。很多癌癥成像研究可以通過OCT和IVM進(jìn)行，但二者在時(shí)間和空間分辨成像深度、視野、標(biāo)簽和可復(fù)用性等方面各有優(yōu)劣勢(shì)（表1）。

 表1. IVM和OCT的成像特點(diǎn)。
活體顯微技術(shù)（intravital microscopy, IVM）

 19世紀(jì)科學(xué)家們就已經(jīng)開始用明場共聚焦顯微鏡利用組織反射信號(hào)進(jìn)行成像，或使用多光子熒光顯微鏡（Multiphoton fluorescent microscopy, MPM）利用二/三次諧波產(chǎn)生對(duì)特定的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像。但明場共聚焦依賴高度半透明的組織，如內(nèi)耳或眼睛，多諧波產(chǎn)生也依賴具有強(qiáng)諧波發(fā)射光譜的組織結(jié)構(gòu)，如膠原和細(xì)胞脂質(zhì)。因此人們又結(jié)合了熒光標(biāo)簽，實(shí)現(xiàn)了對(duì)活體細(xì)胞和分子成像。單光子熒光顯微鏡（1-photon fluorescent microscopy, 1PM）和MPM都能激發(fā)熒光基團(tuán)，1PM能夠同時(shí)對(duì)不同發(fā)射光譜的熒光基團(tuán)進(jìn)行成像，MPM多重性不高但組織穿透性好。熒光基團(tuán)也被設(shè)計(jì)成能夠在脈管系統(tǒng)中長時(shí)間循環(huán)、分子靶向特定的細(xì)胞表面標(biāo)記、能夠穿透細(xì)胞膜并留在細(xì)胞中，或者作為報(bào)告基因被嵌入，無論遷移到哪里都不斷表達(dá)熒光蛋白。還有“智能”納米技術(shù)，能夠根據(jù)微環(huán)境條件變化來部署熒光基團(tuán)和淬滅劑。但使用熒光基團(tuán)需要注意激發(fā)和發(fā)射光譜，使用對(duì)應(yīng)的光源和濾光片組，同時(shí)背景自發(fā)熒光也可能影響成像。熒光壽命成像顯微技術(shù)（fluorescence-lifetime imaging microscopy）通過使用不同壽命的熒光基團(tuán)來區(qū)分將周圍組織，相當(dāng)于一種“時(shí)間門控”增加了成像對(duì)比度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)波長過濾能夠極大便利熒光基團(tuán)的鑒別，方便進(jìn)行腫瘤微環(huán)境的形成和動(dòng)力學(xué)研究。

 IVM通常是在動(dòng)物身上制作一個(gè)窗口或背部皮膚褶小室，來對(duì)表面腫瘤如皮膚腫瘤等進(jìn)行成像。但仍有大部分癌癥處于組織內(nèi)部，如結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌等，可能需要穿透高達(dá)約600μm深度。只能借助外科手術(shù)將需要成像的部位暴露出來，這需要準(zhǔn)備好動(dòng)物模型并嚴(yán)格制定好操作和成像步驟。    

光學(xué)相干斷層掃描（optical coherency tomography, OCT）

 與IVM相對(duì)簡單的光學(xué)系統(tǒng)不同，光學(xué)相干斷層掃描是一種基于干涉測(cè)量的技術(shù)，用近紅外near-infrared （NIR）低相干光照射組織并檢測(cè)來自組織的反向散射光子，反射光與參考光束發(fā)生干涉，記錄干涉圖中不同深度組織反向散射光子的時(shí)間延遲，使用傅立葉變換將其重建為組織掃描圖像。OCT的掃描原理與超聲波類似，都在組織的z軸方向平面捕獲連續(xù)的線性圖像。改變掃描儀的角度，使光束沿x或y軸方向移動(dòng)完成3D結(jié)構(gòu)掃描。OCT可以在沒有造影劑的情況下對(duì)活體組織進(jìn)行解剖學(xué)和生理學(xué)成像，常被用作一種無標(biāo)簽成像技術(shù)。但圖像質(zhì)量和信息水平高度依賴掃描程序和后續(xù)處理算法。如為了檢測(cè)血管，必須在相同的成像位置進(jìn)行重復(fù)掃描并使用特定算法處理掃描信號(hào)以計(jì)算重復(fù)掃描的信號(hào)差。結(jié)合了造影技術(shù)之后，OCT分辨率得到顯著提高并可以擴(kuò)展用于細(xì)胞和分子成像。如通過使用納米造影劑LGNR（large gold nanorods）或GNPR（gold nanoprisms）作血管內(nèi)造影劑，OCT能夠觀察到皮膚表面1 mm以下的毛細(xì)血管，這是使用傳統(tǒng)無標(biāo)記OCT無法做到的。Si等使用microbeads作為造影劑，成功監(jiān)測(cè)了淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體（LYVE-1）的動(dòng)態(tài)表達(dá)。OCT儀器的改進(jìn)也增強(qiáng)了其分辨能力，因?yàn)閳D像質(zhì)量可能受散斑噪聲影響，光學(xué)改進(jìn)后的OCT掃描系統(tǒng)SM-OCT（speckle-modulation OCT）能夠顯著強(qiáng)圖像對(duì)比度和分辨率。de la Zerda等人結(jié)合SM-OCT和造影劑GLNR，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腦腫瘤小鼠模型中腫瘤細(xì)胞瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的體內(nèi)成像，極大擴(kuò)展了OCT對(duì)細(xì)胞成像的能力。John等人結(jié)合水冷電磁體，并使用鐵磁力作為造影劑，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大鼠乳腺癌模型中過表達(dá)的HER2生物標(biāo)志物進(jìn)行分子靶向成像。

 應(yīng)用01-腫瘤解刨學(xué)成像

腫瘤解剖學(xué)包括形狀、大小、邊緣、血管和淋巴管，是臨床和臨床前腫瘤學(xué)研究的重要領(lǐng)域。腫瘤邊緣或邊界可視化對(duì)分析腫瘤進(jìn)程、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)、指導(dǎo)癌癥手術(shù)中起到非常重要的作用。IVM通過基因編碼或靜脈注射熒光團(tuán)使腫瘤細(xì)胞帶上標(biāo)簽進(jìn)行檢測(cè)，OCT通常用于檢測(cè)腫瘤與其周圍組織的內(nèi)在對(duì)比差異確定腫瘤的邊緣。IVM常用于臨床前動(dòng)物來研究腫瘤微環(huán)境，但最近有研究發(fā)現(xiàn)其在人胃腸癌和膀胱癌等內(nèi)腔部位癌癥研究，以及檢測(cè)微小轉(zhuǎn)移性腫瘤中的臨床適用性。但臨床IVM仍面臨幾個(gè)問題，如染料漂白、組織自發(fā)光和非特異性結(jié)合熒光標(biāo)簽導(dǎo)致的假陽性信號(hào)。OCT的優(yōu)勢(shì)在于快速無標(biāo)簽，可以大視野檢測(cè)腫瘤，使其在術(shù)中和術(shù)后評(píng)估腫瘤邊緣中很有優(yōu)勢(shì)。

 腫瘤脈管系統(tǒng)是擴(kuò)散癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、運(yùn)輸免疫細(xì)胞和提供抗癌治療的主要路徑。因此無論是在基礎(chǔ)癌癥研究，還是在臨床檢測(cè)腫瘤進(jìn)展、了解病理狀態(tài)、提供預(yù)后、測(cè)量治療反應(yīng)方面，腫瘤脈管系統(tǒng)可視化都非常重要�；铙w血管成像是IVM和OCT最重要的功能之一。IVM能夠?qū)⒓t細(xì)胞作為天然造影劑，使用線性極化或常規(guī)透照方法，測(cè)量出血管的直徑、長度、毛細(xì)血管間距、分支模式。long-circulating AngioSense或葡聚糖偶聯(lián)的熒光染料等高分子示蹤劑，可以用來在血管泄露到血管外腔之前顯示出血管邊界。在一項(xiàng)術(shù)中IVM研究中，對(duì)黑色素瘤患者靜脈注射熒光染料發(fā)現(xiàn)，約50%的腫瘤血管并不支持血流，而且人腫瘤血管的直徑比之前通過免疫組化方法預(yù)測(cè)的直徑要大。使用OCT對(duì)腫瘤脈管系統(tǒng)進(jìn)行無標(biāo)簽成像的方法很多，如斑點(diǎn)強(qiáng)度方差、相位方差、復(fù)信號(hào)方差等。這些方法都基于對(duì)血管中紅細(xì)胞動(dòng)態(tài)散射的檢測(cè)。Bouma等同時(shí)使用OCT和IVM，對(duì)臨床前小鼠移植模型的MCaIV腫瘤脈管系統(tǒng)進(jìn)行了成像，發(fā)現(xiàn)對(duì)最小的表面毛細(xì)血管進(jìn)行成像時(shí)多光子熒光顯微鏡表現(xiàn)優(yōu)越，但OCT在識(shí)別腫瘤中心區(qū)域更深處血管和一些熒光示蹤劑泄露的區(qū)域方面具有優(yōu)勢(shì)（圖2）。OCT能夠輕易觀察到深度1 mm以上的血管，但多光子熒光顯微鏡只能達(dá)到約600 μm。OCT的瞬時(shí)分辨率是IVM的十倍左右。OCT能夠快速顯示腫瘤的脈管系統(tǒng)，包括與主血管的連接性，這可以彌補(bǔ)IVM的分辨率高但深度不夠。

 無標(biāo)簽OCT除了可以應(yīng)用于腫瘤血管成像，還能用于檢測(cè)光線顯著減弱的深處腫瘤血管和血細(xì)胞比容低的精細(xì)血管結(jié)構(gòu)。Relle等靜脈注射LGNRs作為外源性造影劑，使用OCT掃描顯示出了傳統(tǒng)OCT方法無法檢測(cè)到的更深處的腫瘤微血管（圖3A-D）。Si等報(bào)道稱金納米棱鏡（gold nanoprisms, GNPRs）做血管內(nèi)造影劑，與無標(biāo)簽OCT方法相比，分別在黑色素瘤和腫瘤周圍組織中多檢測(cè)到約60%的血管和約40%的毛細(xì)血管（圖3E-H）。

 除研究血管生成外，IVM和OCT在淋巴管內(nèi)皮發(fā)育和腫瘤周圍淋巴管生成的生理病理學(xué)研究中也有值得注意的發(fā)現(xiàn)。IVM對(duì)小鼠尾部腫瘤進(jìn)行微淋巴管造影術(shù)發(fā)現(xiàn)，腫瘤周圍的淋巴管是增生的。這些腫瘤周圍淋巴管的直徑甚至比過表達(dá)VEGFC的腫瘤里的還大。但過表達(dá)VEGFC并不會(huì)誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)功能性淋巴管的形成。IVM微淋巴管造影技術(shù)通常要局部注射熒光染料并拍攝淋巴管對(duì)染料的吸收和排出（表2），但這會(huì)使注射部位附近精細(xì)結(jié)構(gòu)模糊。無標(biāo)簽OCT對(duì)淋巴管成型的方法是檢測(cè)含有血管形狀和低OCT信號(hào)的組織結(jié)構(gòu)，因?yàn)榱馨鸵菏枪鈱W(xué)透明的，與周圍組織相比幾乎不反射光。利用這種獨(dú)特的光學(xué)特性，已經(jīng)開發(fā)了很多無標(biāo)簽OCT淋巴管造影技術(shù)。Vakoc等發(fā)現(xiàn)可以用該方法分離腫瘤周圍的淋巴管網(wǎng)絡(luò)。皮下注射OCT造影劑能夠增強(qiáng)對(duì)淋巴結(jié)構(gòu)的造影。例如，在小鼠耳朵離散位置分別注射兩種不同類型的LGNRs，可以看到淋巴管。IVM和OCT方法是研究腫瘤周圍淋巴網(wǎng)絡(luò)的有力工具，但活體腫瘤內(nèi)淋巴網(wǎng)絡(luò)由于脈管更深、管腔塌陷和無功能的腫瘤內(nèi)淋巴管等原因，還是很難進(jìn)行成像。

  圖2. 小鼠MCaIV腫瘤模型的OCT和IVM做造影圖像。（A，B）對(duì)移植在背部皮膚褶室中的MCaIV腫瘤使用OCT和MPM進(jìn)行寬視野成像。MPM圖像需要收集并將30-40張3D圖像堆疊以制成與OCT一致的視野。MPM能分辨出組織中深達(dá)400 μm的血管。OCT成像時(shí)間10 min，MPM成像時(shí)間2 h。使用低放大率透鏡可減少M(fèi)PM成像時(shí)間，但要犧牲分辨率和穿透深度。（C，D） A和B圖中上部方框區(qū)域的高倍放大，OCT被增強(qiáng)能看到深層血管，MPM血管滲透區(qū)域形態(tài)學(xué)區(qū)分清晰。（E，F(xiàn)） A和B圖中下部方框區(qū)高倍放大，MPM和OCT獲得的更精細(xì)血管結(jié)構(gòu)的更多細(xì)節(jié)。（G-I）將自動(dòng)血管追蹤用于OCT和MPM得到的圖像上，量化OCT造影的分辨率，同時(shí)驗(yàn)證OCT的形態(tài)學(xué)測(cè)量。

應(yīng)用02-腫瘤生理學(xué)成像

通過血液散播造影劑需要通過脈管系統(tǒng)輸送，經(jīng)血管交換進(jìn)入組織，擴(kuò)散或?qū)α鞔┻^間隙空間，并被腫瘤邊緣的淋巴管清除，藥物向腫瘤的有效輸送也要遵循相同的路徑。IVM成像研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中的血液灌注在空間和時(shí)間上是不均勻的，這表明腫瘤內(nèi)資源分布不均可能導(dǎo)致腫瘤性質(zhì)不均一，導(dǎo)致藥物處理和疾病進(jìn)展出現(xiàn)差異。此外一些腫瘤中，平均紅細(xì)胞速度低于宿主血管，且與血管直徑無關(guān)，表明血液和間質(zhì)壓力發(fā)生了變化。

 OCT作為一種測(cè)量血流速度和血流動(dòng)力學(xué)的定量工具已經(jīng)得到了大量的應(yīng)用。Doppler OCT （D-OCT）被用于測(cè)量動(dòng)脈和靜脈中的軸向血流速度，但是這種技術(shù)不能檢測(cè)垂直角度和容易受到組織運(yùn)動(dòng)影響的血流。Merkle等人開發(fā)了動(dòng)態(tài)對(duì)比光學(xué)相干斷層掃描（DyC-OCT），對(duì)在血管內(nèi)示蹤劑（靜脈注射脂肪乳劑）通過視野時(shí)對(duì)其進(jìn)行成像克服了這一限制。這項(xiàng)技術(shù)也可用于測(cè)量微血管血流動(dòng)力學(xué)。

 了解腫瘤淋巴流動(dòng)模式為研究腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供了生理學(xué)基礎(chǔ)�；铙w技術(shù)可精確測(cè)量毛淋巴管中的流體速度（表2）。IVM研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)VEGFC誘導(dǎo)小鼠皮膚淋巴管增生會(huì)減弱淋巴流動(dòng)，并且腫瘤內(nèi)沒有引流淋巴液的功能性淋巴管。
使用無標(biāo)簽OCT或造影劑增強(qiáng)的OCT都能夠看到淋巴液。Blatter和同事開發(fā)了一種無標(biāo)簽D-OCT方法測(cè)量淋巴液流速。最新研究中，出現(xiàn)了基于GNBPs的多路復(fù)用OCT造影劑，允許觀測(cè)多種生物過程如腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍的淋巴流動(dòng)。一項(xiàng)研究表明，腫瘤內(nèi)注射的造影劑會(huì)流到周圍淋巴管和前哨淋巴結(jié)中，皮下注射的造影劑也能夠流入腫瘤內(nèi)部、周圍淋巴管和同樣的前哨淋巴結(jié)（圖3K）。
 

 圖3. 幾種可用于增強(qiáng)OCT腫瘤血管造影和多路淋巴造影的OCT造影劑。

（A） LGNRs的透射電子顯微鏡圖像，平均長度107 ± 7 nm，平均寬度32 ± 2 nm，平均縱橫比3.4。（B） LGNRs的可見近紅外（Vis-NIR）吸收光譜，在815 nm處顯示出縱向等離子共振峰。（C，D）靜脈注射LGNRs前后，小鼠耳移植的U87MG腫瘤的光譜對(duì)比OCT圖像。LGNRs提高了OCT圖像中血管的對(duì)比度，使OCT能夠檢測(cè)腫瘤深處的小血管（白色箭頭）。（E） GNPR的TEM圖像，平均邊長約140 nm。（F） LGNRs的可見近紅外吸收光譜，1385 nm處顯示出縱向等離子共振峰。（G，H）靜脈注射0.75 nMPEGylated GNPR前和注射5 min后，帶有黑色素瘤的小鼠耳朵組織的正面投影OCT血管造影圖片。彩色圖顯示組織表面下方的脈管深度。注射后，可見腫瘤內(nèi)約60%以上的微血管。（I）縱橫比不同的GNBPs（GNBP-Ⅰ和-Ⅱ）做多路OCT造影劑的TEM圖像。（J） GNBP-Ⅰ和GNBP-Ⅱ的近紅外光譜。（K）移植腫瘤的小鼠耳朵血管網(wǎng)絡(luò)流量門控光譜OCT圖像，左為注射造影劑前，中為腫瘤內(nèi)注射GNBP-Ⅰ的腫瘤及周圍淋巴管，右為皮下注射GNBP-Ⅰ和GNBP-Ⅱ的腫瘤及周圍淋巴管。

 表2. 使用IVM和OCT技術(shù)進(jìn)行的體內(nèi)腫瘤成像  

應(yīng)用03-腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)白細(xì)胞成像

了解腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞行為對(duì)于揭示腫瘤發(fā)育的潛在機(jī)制和開發(fā)新療法非常關(guān)鍵。IVM是研究腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞行為的常用技術(shù)，包括腫瘤細(xì)胞和相關(guān)免疫細(xì)胞的遷移。了解腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞行為對(duì)于闡明腫瘤發(fā)展的潛在機(jī)制和開發(fā)新的治療方法至關(guān)重要，可以幫助闡明癌癥的進(jìn)展、消退、轉(zhuǎn)移以及對(duì)各種治療的反應(yīng)。淋巴轉(zhuǎn)移是幫助腫瘤細(xì)胞從原始位置擴(kuò)散到身體其他部位的關(guān)鍵過程。IVM已被用于識(shí)別淋巴轉(zhuǎn)移過程各步驟。例如，對(duì)鼠淋巴瘤模型中的淋巴結(jié)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，脾和骨構(gòu)建淋巴結(jié)后會(huì)產(chǎn)生浸潤的腫瘤細(xì)胞，并不是我們之前假設(shè)的那樣是從腫瘤原始位置運(yùn)輸過來的。通過使用表達(dá)腫瘤特異性報(bào)告熒光團(tuán)的轉(zhuǎn)基因小鼠，IVM可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)淋巴管中的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。常規(guī)IVM必須在動(dòng)物麻醉的情況下進(jìn)行，但Pereira等也實(shí)現(xiàn)了某種情況下的無麻醉成像。隨著研究的深入，這可能會(huì)逐漸成為一個(gè)受關(guān)注的問題，尤其是需要進(jìn)行幾天幾周甚至更長時(shí)間的成像觀察，或者需要對(duì)清醒或能夠?qū)Υ碳ぎa(chǎn)生即時(shí)反應(yīng)的動(dòng)物進(jìn)行成像，或者麻醉可能影響成像的細(xì)胞和分子時(shí)。

腫瘤相關(guān)白細(xì)胞介導(dǎo)癌癥的原發(fā)過程和抗原發(fā)過程，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞是兩種重要的免疫細(xì)胞，會(huì)對(duì)多種癌癥免疫療法的療效產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響。通過利用先進(jìn)的熒光標(biāo)記技術(shù)，IVM能夠同時(shí)長期的追蹤腫瘤微環(huán)境中多種白細(xì)胞和治療因子，從而幫助闡明腫瘤微環(huán)境中白細(xì)胞的募集、粘附和行為，量化白細(xì)胞對(duì)各種治療劑的反應(yīng)，同時(shí)幫助闡明導(dǎo)致癌癥免疫療法耐藥性的機(jī)制。Junankar等人使用real-time 2-photon IVM發(fā)現(xiàn)TAMs會(huì)吞噬結(jié)合到乳腺腫瘤小顆粒微鈣化上的雙膦酸鹽藥物。Arlauckas等人在抗PD-1免疫療法中同時(shí)對(duì)TAMs、CD8+ T細(xì)胞和治療因子的分布進(jìn)行了30 min的跟蹤，發(fā)現(xiàn)抗PD-1單克隆抗體（aPD-1 mAbs）在注射后6-15 min會(huì)短暫結(jié)合CD8+ T細(xì)胞，但最終這些抗體會(huì)被臨近的TAMs捕獲并保留（圖4A）。隨著過度表達(dá)或缺乏相關(guān)分子的基因工程小鼠模型越來越多，前有熒光譜系追蹤模型和后有基因敲除模型，IVM能夠繼續(xù)幫助人們對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行更深入了解，揭開腫瘤-免疫系統(tǒng)相互作用的神秘面紗，改進(jìn)癌癥治療方法。
OCT最近才被用于研究腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞的遷移。與IVM相比，OCT成像視野更大，分辨率更高（表1），如掃描300 × 20 × 200μm體積的組，IVM通常需要1秒，而OCT通常需要0.02秒。de la Zerda等人報(bào)道了基于contrast-enhanced SM-OCT技術(shù)的白細(xì)胞縱向成像。用LGNR造影劑在小鼠原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型中對(duì)TAMs和活化的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)標(biāo)記，由此對(duì)腫瘤內(nèi)TAM遷移和分布進(jìn)行了實(shí)時(shí)跟蹤（圖4B）。這使我們能夠詳細(xì)研究TAMs在體內(nèi)的基本行為，包括它們?cè)谀[瘤內(nèi)的分布異質(zhì)性以及在調(diào)節(jié)增殖中的作用。除了白細(xì)胞追蹤，研究人員還實(shí)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)追蹤。這項(xiàng)研究標(biāo)志著OCT首次用于檢測(cè)體內(nèi)血液中的單個(gè)細(xì)胞。我們大可期待這一技術(shù)在動(dòng)態(tài)檢測(cè)和量化活體內(nèi)循環(huán)的腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用效果。

Smith等人使用IVM結(jié)合熒光團(tuán)標(biāo)記的單壁碳納米管（single-walled carbon nanotubes, SWNTs），靜脈注射到小鼠中后，直接觀察到單壁碳納米管選擇性積累到單核細(xì)胞中，并觀測(cè)到了其自然運(yùn)輸、外滲和進(jìn)入腫瘤過程（圖4F-H）。研究發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管通過進(jìn)入炎癥單核細(xì)胞，作為“特洛伊木馬”溢出并進(jìn)入腫瘤中，導(dǎo)致觀察到非常高的腫瘤積聚性�；蛟S這些單壁碳納米管可用于對(duì)炎性單核細(xì)胞運(yùn)輸?shù)降牟课贿M(jìn)行成像，或用于治療這些炎性單核細(xì)胞，因?yàn)檠仔詥魏思?xì)胞與許多疾病包括從癌癥到動(dòng)脈粥樣硬化到神經(jīng)退行性疾病還有關(guān)節(jié)炎，都有關(guān)系。因此，結(jié)合使用納米材料，可以通過IVM在微尺度上實(shí)現(xiàn)血管和腫瘤動(dòng)力學(xué)可視化，這為單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞成像，癌癥及其他疾病的治療提供了潛在基礎(chǔ)。IVM能做到多顏色和高分辨率，可用于確定單壁碳納米管或其他納米材料在疾病部位的定位，還可以通過評(píng)估細(xì)胞殺傷（如注射凋亡信號(hào)試劑）、激活和向其他細(xì)胞表型分化來進(jìn)行治療方法的調(diào)整。但要同時(shí)進(jìn)行多維分析，要觀察各種細(xì)胞類型、血管特征、細(xì)胞狀態(tài)和分子的高度交互系統(tǒng)，則需要更多顏色，更新的算法。

 圖4. IVM和OCT追蹤腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）和單核細(xì)胞遷移。

（A）在使用MC38–H2B-mApple腫瘤小鼠模型進(jìn)行抗PD-1免疫治療期間，對(duì)TAMs（Pacific blue–dextran納米顆粒標(biāo)記）、T細(xì)胞（YFP標(biāo)記）和抗PD-1抗體（AF647標(biāo)記）進(jìn)行縱向和同時(shí)IVM成像。黃色箭頭表示PD-1抗體在6-15min時(shí)與CD8+ T細(xì)胞結(jié)合的位點(diǎn)，21min以后在巨噬細(xì)胞內(nèi)的位點(diǎn)。比例尺30 μm。（B）注射40h后腫瘤（帶顏色）和周圍腦實(shí)質(zhì)（灰色）的正面SM-OCT圖像。（C）腦腫瘤中TAM遷移的time-resolved OCT圖像。斑點(diǎn)方差檢測(cè)腫瘤脈管系統(tǒng)（紅色）。（D，E）從注射后40h到注射后41.5h隨機(jī)選擇的TAMs的遷移軌跡圖。（F）單壁碳納米管與PEG非共價(jià)包被示意圖，疏水段（淺藍(lán)色）與單壁碳納米管表面相連，親水段（綠色）與Cy5.5熒光染料（紅色球體）和/或RGD（或RAD）肽（藍(lán)色環(huán)狀球結(jié)構(gòu)）相連。（G）腫瘤脈管系統(tǒng)內(nèi)，負(fù)載單壁碳納米管的循環(huán)單核細(xì)胞的IVM熒光圖像（圈出的細(xì)胞為例）。（H）腫瘤區(qū)域的代表性活體顯微圖片。

 應(yīng)用04-分子標(biāo)志物和腫瘤動(dòng)力學(xué)的成像

IVM和OCT都能夠通過使用合適的造影劑對(duì)腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)的生物標(biāo)記物進(jìn)行成像。已有研究使用OCT進(jìn)行了單個(gè)癌癥標(biāo)志物的分子成像，結(jié)合新的OCT造影劑有望在未來實(shí)現(xiàn)多重成像。IVM已經(jīng)廣泛用于癌癥生物標(biāo)志物的多重標(biāo)記和成像，在腫瘤異質(zhì)性研究中得出很多成果。由于IVM分辨率更高，在監(jiān)測(cè)藥物輸送和腫瘤進(jìn)展中涉及的各種細(xì)胞內(nèi)分子事件方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如基因表達(dá)/調(diào)節(jié)、酶活性和信號(hào)通路。還可以用于監(jiān)測(cè)許多其他納米粒子，新抗體或小分子藥物的在體內(nèi)的循環(huán)和生物效應(yīng)。監(jiān)測(cè)酶的活性需要分子探針，可以通過與酶或其產(chǎn)物的特定相互作用來改變其光學(xué)性質(zhì)。已有研究使用近紅外光源監(jiān)測(cè)組織蛋白酶B和許多其他酶的活性。為使基因表達(dá)可視化，需要開發(fā)由特定啟動(dòng)子控制的各種熒光蛋白（例如綠色熒光蛋白）的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或動(dòng)物。如Leben等人利用這種方法研究了神經(jīng)系統(tǒng)疾病中NAD（P）H代謝的動(dòng)力學(xué)。這些研究的測(cè)量顯示，癌癥的基本分子驅(qū)動(dòng)因素，如對(duì)新治療的遺傳或酶反應(yīng)，可能是癌癥治療的關(guān)鍵靶標(biāo)部分。

對(duì)比增強(qiáng)的OCT技術(shù)（contrast-enhanced OCT）能夠?qū)�體內(nèi)細(xì)胞生物標(biāo)志物進(jìn)行分子成像。Boppart等人使用磁動(dòng)OCT（magnetomotive-OCT）和結(jié)合了抗體的鐵磁氧化鐵納米粒子做造影劑，在乳腺癌大鼠模型中實(shí)現(xiàn)了HER2的靶向分子成像。隨著外加磁場的變化，納米粒子旋轉(zhuǎn)并攪動(dòng)周圍細(xì)胞，因此通過OCT可以檢測(cè)到的局部光學(xué)散射特性的變化。Si等人研究發(fā)現(xiàn)，具有靶向性的聚苯乙烯MBs也可以用作光學(xué)相干斷層掃描的分子造影劑。LYVE-1是一種對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥敏感的重要淋巴生物標(biāo)志物。靶向結(jié)合了LYVE-1的MBs發(fā)生相位變化可使用OCT進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)LYVE-1在小鼠炎癥模型中的動(dòng)態(tài)表達(dá)可視化。這項(xiàng)技術(shù)還可能用于與腫瘤誘導(dǎo)的炎癥和淋巴管生成相關(guān)的分子動(dòng)力學(xué)研究中。已經(jīng)有研究正在開發(fā)新的contrast-enhanced OCT方法，以實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)更多腫瘤相關(guān)淋巴管和血管生物標(biāo)志物，包括VEGFR-2、VEGFR-3、血管細(xì)胞粘附分子1、血小板和內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1等等。 

應(yīng)用05-IVM和OCT在腫瘤成像中的結(jié)合

 IVM和OCT是互補(bǔ)的技術(shù)，將兩者結(jié)合的多模式系統(tǒng)可以在臨床前環(huán)境中增強(qiáng)癌癥成像，并在臨床環(huán)境中支持更好的惡性腫瘤診斷。已經(jīng)有研究在內(nèi)窺鏡或膀胱鏡中將二者結(jié)合起來，顯示了增強(qiáng)腫瘤學(xué)特征的潛力。IVM和OCT結(jié)合成像技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是可以同時(shí)表征腫瘤的解剖結(jié)構(gòu)和分子特征。Iftimia等人報(bào)道了一種fluorescence-guided OCT方法，在結(jié)腸直腸腺瘤的臨床前小鼠模型中，皮內(nèi)注射RGD肽結(jié)合的熒光微粒后，首次使用IVM篩查了結(jié)腸癌定位，然后使用OCT驗(yàn)證IVM識(shí)別的腫瘤組織并檢查結(jié)腸癌形態(tài)學(xué)。還有研究人員進(jìn)一步報(bào)道了fluorescence-guided OCT膀胱鏡在大鼠膀胱癌早期檢測(cè)中的應(yīng)用。該方法還能夠減少膀胱癌檢測(cè)中的假陽性。Tang等人將高靈敏度熒光層狀光學(xué)斷層成像（fluorescence laminar optical tomography）和OCT內(nèi)窺鏡用于C57BL/6J-ApcMin/J小鼠模型中結(jié)腸癌的結(jié)構(gòu)和酶活性成像。Li等人使用同步配準(zhǔn)近紅外熒光成像（simultaneous coregistered NIR fluorescence imaging）和OCT，開發(fā)了一種多模式內(nèi)窺鏡系統(tǒng)，通過同時(shí)觀察胃腸道的微血管和形態(tài)學(xué)變化，可以實(shí)現(xiàn)早期檢測(cè)結(jié)直腸癌。在F344-ApcPircUwm大鼠模型中，該成像技術(shù)能夠成功識(shí)別和區(qū)分正常結(jié)腸、增生性息肉、腺瘤性息肉和惡性腺瘤。目前大多數(shù)OCT造影劑都是近年出現(xiàn)的，尚未得到FDA批準(zhǔn)，但這并不妨礙我們期待在臨床結(jié)合使用這兩種技術(shù)，會(huì)對(duì)形態(tài)學(xué)和分子成像有極大改善。

結(jié)束語

IVM和OCT在分辨率和成像深度方面是互補(bǔ)的光學(xué)成像技術(shù)，各自在基礎(chǔ)癌癥生物學(xué)研究和臨床腫瘤學(xué)研究中有獨(dú)特引用。IVM分辨率高（＜0.5 μm），但組織穿透有限（＜600μm）。OCT分辨率（5-10 μm）較低，但組織穿透性好（2-3mm）、掃描速度更快、視野更寬。二者都可以標(biāo)記和無標(biāo)記方法使用。IVM結(jié)合多種標(biāo)記方法后能成為一種非常強(qiáng)大的工具，可用于癌癥藥物輸送、基因表達(dá)和基礎(chǔ)癌癥研究中酶活性的細(xì)胞跟蹤和分子成像。多諧波生成等無標(biāo)記技術(shù)使IVM能夠?qū)δ[瘤微環(huán)境的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)成像，如細(xì)胞外基質(zhì)和類脂體。OCT與原本是一種無標(biāo)記技術(shù)，用于腫瘤解剖成像和腫瘤邊緣檢測(cè)，更新迭代的光學(xué)設(shè)計(jì)和成像算法使成像能力得到顯著提高。新興的造影劑和標(biāo)記技術(shù)擴(kuò)展了OCT在活體癌癥的生理、細(xì)胞和分子成像方面的能力，開辟了基礎(chǔ)癌癥研究和臨床腫瘤學(xué)研究的新領(lǐng)域。表2總結(jié)了各種新興的IVM和OCT技術(shù)，這些技術(shù)已用于癌癥的解剖學(xué)、生理學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子成像。

  未來在光學(xué)設(shè)計(jì)、算法開發(fā)和造影劑方面創(chuàng)新使用，將進(jìn)一步增強(qiáng)臨床前和臨床癌癥成像效果，并實(shí)現(xiàn)更多臨床腫瘤學(xué)應(yīng)用。隨著新的造影劑、標(biāo)記技術(shù)和算法的進(jìn)步，擴(kuò)展可復(fù)用性可能是未來IVM和OCT的主要技術(shù)進(jìn)步方向。例如，光譜分離技術(shù)的發(fā)展允許使用MPM同時(shí)激發(fā)和檢測(cè)在不同細(xì)胞和組織區(qū)室中表達(dá)的七種熒光團(tuán)，可以分辨更多的標(biāo)記，并獲取更多關(guān)于活體內(nèi)癌細(xì)胞類型、細(xì)胞狀態(tài)和組織結(jié)構(gòu)的信息。將體內(nèi)光學(xué)成像與電子顯微鏡成像、流式細(xì)胞術(shù)、RNA測(cè)序和蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合，可以進(jìn)一步擴(kuò)展IVM和OCT在分子癌癥研究方面的應(yīng)用。除此之外，先進(jìn)的計(jì)算機(jī)算法、云計(jì)算和人工智能的發(fā)展也將極大促進(jìn)未來大型IVM和OCT數(shù)據(jù)集的分析。最終會(huì)極大促進(jìn)我們?cè)谠缙诎┌Y檢測(cè)、癌癥類型分類、腫瘤內(nèi)異質(zhì)性繪圖、治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)以及成像結(jié)果與下游分子分析等研究中的進(jìn)展。

 

參考文獻(xiàn)：

Si, P. , Honkala, A. , Zerda, A. D. L. , & Smith, B. R. . (2020). Optical microscopy and coherence tomography of cancer in living subjects.