通過光學成像測量清醒的小鼠腦血流和血流動力學改變
今天我們向大家介紹一種測量清醒狀態(tài)下的小鼠腦血流檢測方法，文章中作者通過光學相干斷層成像（OCTA）和內(nèi)在光學信號成像（IOSI）檢測完全清醒小鼠的腦血流和血流動力學。文章中詳細介紹了顱骨窗的準備過程，并對清醒的小鼠腦部血流進行穩(wěn)定的光學記錄，以及實現(xiàn)多參數(shù)血流動力學測量的成像方法。結(jié)果表明，通過使用OCTA技術，可以在動物完全清醒狀態(tài)下可靠地繪制出高分辨率的腦血管系統(tǒng)，包括穿透性小動脈和毛細血管床的流速測量。最后，文章展示了在小鼠清醒狀態(tài)下施加觸須刺激時小鼠腦部皮質(zhì)層的血流動力學改變。相信這里介紹的這種方法將有助于記錄在清醒正常狀態(tài)下的動物模型的真實血流動力學改變，這為許多新的研究方向打開了全新的視野，并可以將將神經(jīng)刺激與微循環(huán)的改變進行更緊密的聯(lián)系和研究。
顱窗的建立和檢測設備的搭建
首先作者在第0天通過異氟醚全麻對小鼠進行顱骨窗手術，然后在動物房進行手術恢復7天。在恢復期內(nèi)，除了基本的術后監(jiān)護和顱窗數(shù)碼攝影外，沒有進行任何影像學和訓練。從第8天開始，每天將小鼠帶回實驗室，進行至少連續(xù)4天的處理和訓練，以使其適應實驗室環(huán)境、實驗者和頭部約束裝置，老鼠在頭部約束成像之前接受了額外的訓練（詳細見原文鏈接）。在研究的第12天開始進行第一次清醒成像，使用IOSI和OCTA進行頭部約束成像所需的最長時間為40分鐘。為了進行演示，我們在老鼠身上執(zhí)行了IOSI和所有三種OCTA協(xié)議，但是可以根據(jù)未來研究的目的選擇性地執(zhí)行這些協(xié)議。如果操作和訓練良好，老鼠可以每天成像，長達4個月。在實驗的最后一天，老鼠被麻醉成像然后anlesi，或者在麻醉下直接anlesi。
圖一：A） 實驗時間線。B） 安裝顱骨窗的腦部顯微鏡圖像。C） 開顱手術的橫斷面解剖。D） 安裝固定裝置和顱窗后的顯微鏡圖像。E） 顱骨植入物的示意圖和尺寸。F） 從第0天到第14天顱骨窗的一系列顯微鏡圖像。G） ，H）和I）頭部約束裝置的3步操作/培訓。
在使用OCTA采集腦部血流信號的過程中，使用內(nèi)部構建的雙模光學成像平臺。OCTA在小鼠腦組織中達到∼5.1µm的軸向分辨率和∼10µm的橫向分辨率。并為樣品提供2.22 mm的成像深度。下圖為實驗過程中示意圖。
圖二：A）光學成像系統(tǒng)的示意圖。SLD：超發(fā)光二極管，PC：偏振控制器，PC（bold）：個人計算機。B）鼠標觸須刺激設置的示意圖。C）和E）使用OCTA成像。D）和F）使用IOSI進行成像。
OCTA技術在清醒小鼠腦血流顯像中的應用
在建立顱窗模型后第14天，作者使用OCTA掃描成像在清醒小鼠中獲得了高分辨率的血管系統(tǒng)圖像和血流灌注動力學圖像。下圖中的所有結(jié)果都是在清醒的小鼠處于靜息狀態(tài)（無刺激）時獲得的。結(jié)果顯示了小鼠腦部的三維血管系統(tǒng)的血管圖像并獲得了此范圍內(nèi)的斷層圖像，通過這些圖像作者發(fā)現(xiàn)在皮質(zhì)層上方生長著一層血管豐富的腦膜組織，這在之前的急性顱骨窗中沒有發(fā)現(xiàn)。因此為了增強皮質(zhì)血管系統(tǒng)的可視化，作者使用半自動分割軟件將顱窗下的腦組織分離成腦膜層（L1）和皮質(zhì)層（L2），如圖3（C）中的黃色分割線所示。在去除L1中的尾隨偽影后，生成新的正面投影圖像圖3（L2）。與圖3（A）中的原始投影圖像相比，L2的皮質(zhì)血管系統(tǒng)可以得到更好的成像效果和對比度。之后作者又通過DOCTA對顱窗進行成像并進行血流檢測，結(jié)果顯示穿透小動脈（綠色）和上升小靜脈（紅色）的雙向軸向速度，速度范圍為6.1 mm/s至-6.1 mm/s如圖3（D）。為了更準確地評估毛細管動力學，作者將直徑大于15µm的較大血管進行掩蔽來去除信號。進一步處理的速度圖如圖3（F）所示。圖3（G）和圖3（H）中的橫截面展示了掩蔽大流量信號前后的差異。
圖三：A） 顱窗手術后第14天清醒小鼠靜息狀態(tài)下全深度3D-OCTA數(shù)據(jù)集的EN-FACE面最大強度投影（MIP）。B） OCTA斷層結(jié)構在圖A中紅色虛線位置的橫截面。C）帶有L1和L2黃色分割線的OCTA血流橫截面。右側(cè)顯示了兩個分割層的EN-FACE面圖像。D） 利用三維DOCTA數(shù)據(jù)集的MIP生成雙向軸向速度圖。彩色條代表紅細胞在±6.1 mm/s范圍內(nèi)從皮質(zhì)表面下降（正，綠色）和上升（負，紅色）的血流軸向速度。E） 和F）顯示了300µm厚平面內(nèi)3D毛細管速度測量數(shù)據(jù)集的平均強度投影（AIP），分別對應于它們的橫截面G）和H）。此圖中的所有比例尺代表500µm。
清醒小鼠觸須刺激的血流動力學研究
接著作者使用IOSI揭示了清醒狀態(tài)下小鼠桶狀皮質(zhì)神經(jīng)活動引起的血流動力學變化。圖4(A)上圖顯示了尚未觸須刺激時，圖像采集時的相對反射率（-ΔR/R）。下圖顯示圖像采集15秒時的-ΔR/R圖（觸須刺激5秒）。結(jié)果顯示通過刺激引起的血流動力學反應被觀察到血管與背景的對比度更高，相應地，由于激活，桶皮質(zhì)的總血紅蛋白（充血）局部增加。在IOSI結(jié)果的指導下，在桶皮質(zhì)（R1）和對照區(qū)（R2）進行了八次毛細管速度掃描。圖4（B）-（E）顯示了這兩個區(qū)域在不同狀態(tài)下的毛細管速度圖。繪制了速度信號的直方圖分布圖，以比較與休息和刺激的差異。在R1中，如圖（D）所示，RBC速度在統(tǒng)計上增加，使得刺激狀態(tài)的分布稍微向右傾斜。這也符合圖4（C）中的觀察結(jié)果，其中一些速度信號在觸須刺激期間被增強。相反，對照區(qū)（R2）的兩個分布大部分是重疊的圖4（G），刺激后沒有觀察到分布位移。
圖四：A） IOSI刺激小鼠觸須過程中桶狀皮質(zhì)的寬場反射圖。上圖：2秒數(shù)據(jù)采集（無刺激）。下圖：15秒數(shù)據(jù)采集（5秒觸須刺激）。R1表示觸須刺激時血流動力學反應激活，R2為未觀察到反應的對照區(qū)。比例尺代表1 mm。B） -E）是不同狀態(tài)下兩個區(qū)域的三維測速數(shù)據(jù)集的EN-FACE面AIP圖像。在遮蓋大血管后，在300µm厚的平面內(nèi)生成圖像，剩余的毛細管速度信號用F（R1）和G（R2）的直方圖分布繪制。分布直方圖中的插圖表示從刺激到休息的減法。比例尺為200µm。
好了，文章讀到這里不知道大家有什么新的想法呢。小編覺得本文介紹的方法對清醒小鼠腦血流的光學成像具有很大指導意義，有望為清醒行為動物的實驗開辟新的視野，以進行腦功能和藥物開發(fā)的基礎研究。今天就到這里吧，歡迎有對OCTA技術感興趣的老師們找我進行溝通咨詢，讓我們一起探索這奇妙的動物實驗吧!
參考文獻Li Y, Rakymzhan A, Tang P, Wang RK. Procedure and protocols for optical imaging of cerebral blood flow and hemodynamics in awake mice. Biomed Opt Express. 2020;11(6):3288-3300. Published 2020 May 26. doi:10.1364/BOE.394649
顱窗的建立和檢測設備的搭建
首先作者在第0天通過異氟醚全麻對小鼠進行顱骨窗手術，然后在動物房進行手術恢復7天。在恢復期內(nèi)，除了基本的術后監(jiān)護和顱窗數(shù)碼攝影外，沒有進行任何影像學和訓練。從第8天開始，每天將小鼠帶回實驗室，進行至少連續(xù)4天的處理和訓練，以使其適應實驗室環(huán)境、實驗者和頭部約束裝置，老鼠在頭部約束成像之前接受了額外的訓練（詳細見原文鏈接）。在研究的第12天開始進行第一次清醒成像，使用IOSI和OCTA進行頭部約束成像所需的最長時間為40分鐘。為了進行演示，我們在老鼠身上執(zhí)行了IOSI和所有三種OCTA協(xié)議，但是可以根據(jù)未來研究的目的選擇性地執(zhí)行這些協(xié)議。如果操作和訓練良好，老鼠可以每天成像，長達4個月。在實驗的最后一天，老鼠被麻醉成像然后anlesi，或者在麻醉下直接anlesi。
圖一：A） 實驗時間線。B） 安裝顱骨窗的腦部顯微鏡圖像。C） 開顱手術的橫斷面解剖。D） 安裝固定裝置和顱窗后的顯微鏡圖像。E） 顱骨植入物的示意圖和尺寸。F） 從第0天到第14天顱骨窗的一系列顯微鏡圖像。G） ，H）和I）頭部約束裝置的3步操作/培訓。
在使用OCTA采集腦部血流信號的過程中，使用內(nèi)部構建的雙模光學成像平臺。OCTA在小鼠腦組織中達到∼5.1µm的軸向分辨率和∼10µm的橫向分辨率。并為樣品提供2.22 mm的成像深度。下圖為實驗過程中示意圖。
圖二：A）光學成像系統(tǒng)的示意圖。SLD：超發(fā)光二極管，PC：偏振控制器，PC（bold）：個人計算機。B）鼠標觸須刺激設置的示意圖。C）和E）使用OCTA成像。D）和F）使用IOSI進行成像。
OCTA技術在清醒小鼠腦血流顯像中的應用
在建立顱窗模型后第14天，作者使用OCTA掃描成像在清醒小鼠中獲得了高分辨率的血管系統(tǒng)圖像和血流灌注動力學圖像。下圖中的所有結(jié)果都是在清醒的小鼠處于靜息狀態(tài)（無刺激）時獲得的。結(jié)果顯示了小鼠腦部的三維血管系統(tǒng)的血管圖像并獲得了此范圍內(nèi)的斷層圖像，通過這些圖像作者發(fā)現(xiàn)在皮質(zhì)層上方生長著一層血管豐富的腦膜組織，這在之前的急性顱骨窗中沒有發(fā)現(xiàn)。因此為了增強皮質(zhì)血管系統(tǒng)的可視化，作者使用半自動分割軟件將顱窗下的腦組織分離成腦膜層（L1）和皮質(zhì)層（L2），如圖3（C）中的黃色分割線所示。在去除L1中的尾隨偽影后，生成新的正面投影圖像圖3（L2）。與圖3（A）中的原始投影圖像相比，L2的皮質(zhì)血管系統(tǒng)可以得到更好的成像效果和對比度。之后作者又通過DOCTA對顱窗進行成像并進行血流檢測，結(jié)果顯示穿透小動脈（綠色）和上升小靜脈（紅色）的雙向軸向速度，速度范圍為6.1 mm/s至-6.1 mm/s如圖3（D）。為了更準確地評估毛細管動力學，作者將直徑大于15µm的較大血管進行掩蔽來去除信號。進一步處理的速度圖如圖3（F）所示。圖3（G）和圖3（H）中的橫截面展示了掩蔽大流量信號前后的差異。
圖三：A） 顱窗手術后第14天清醒小鼠靜息狀態(tài)下全深度3D-OCTA數(shù)據(jù)集的EN-FACE面最大強度投影（MIP）。B） OCTA斷層結(jié)構在圖A中紅色虛線位置的橫截面。C）帶有L1和L2黃色分割線的OCTA血流橫截面。右側(cè)顯示了兩個分割層的EN-FACE面圖像。D） 利用三維DOCTA數(shù)據(jù)集的MIP生成雙向軸向速度圖。彩色條代表紅細胞在±6.1 mm/s范圍內(nèi)從皮質(zhì)表面下降（正，綠色）和上升（負，紅色）的血流軸向速度。E） 和F）顯示了300µm厚平面內(nèi)3D毛細管速度測量數(shù)據(jù)集的平均強度投影（AIP），分別對應于它們的橫截面G）和H）。此圖中的所有比例尺代表500µm。
清醒小鼠觸須刺激的血流動力學研究
接著作者使用IOSI揭示了清醒狀態(tài)下小鼠桶狀皮質(zhì)神經(jīng)活動引起的血流動力學變化。圖4(A)上圖顯示了尚未觸須刺激時，圖像采集時的相對反射率（-ΔR/R）。下圖顯示圖像采集15秒時的-ΔR/R圖（觸須刺激5秒）。結(jié)果顯示通過刺激引起的血流動力學反應被觀察到血管與背景的對比度更高，相應地，由于激活，桶皮質(zhì)的總血紅蛋白（充血）局部增加。在IOSI結(jié)果的指導下，在桶皮質(zhì)（R1）和對照區(qū)（R2）進行了八次毛細管速度掃描。圖4（B）-（E）顯示了這兩個區(qū)域在不同狀態(tài)下的毛細管速度圖。繪制了速度信號的直方圖分布圖，以比較與休息和刺激的差異。在R1中，如圖（D）所示，RBC速度在統(tǒng)計上增加，使得刺激狀態(tài)的分布稍微向右傾斜。這也符合圖4（C）中的觀察結(jié)果，其中一些速度信號在觸須刺激期間被增強。相反，對照區(qū)（R2）的兩個分布大部分是重疊的圖4（G），刺激后沒有觀察到分布位移。
圖四：A） IOSI刺激小鼠觸須過程中桶狀皮質(zhì)的寬場反射圖。上圖：2秒數(shù)據(jù)采集（無刺激）。下圖：15秒數(shù)據(jù)采集（5秒觸須刺激）。R1表示觸須刺激時血流動力學反應激活，R2為未觀察到反應的對照區(qū)。比例尺代表1 mm。B） -E）是不同狀態(tài)下兩個區(qū)域的三維測速數(shù)據(jù)集的EN-FACE面AIP圖像。在遮蓋大血管后，在300µm厚的平面內(nèi)生成圖像，剩余的毛細管速度信號用F（R1）和G（R2）的直方圖分布繪制。分布直方圖中的插圖表示從刺激到休息的減法。比例尺為200µm。
好了，文章讀到這里不知道大家有什么新的想法呢。小編覺得本文介紹的方法對清醒小鼠腦血流的光學成像具有很大指導意義，有望為清醒行為動物的實驗開辟新的視野，以進行腦功能和藥物開發(fā)的基礎研究。今天就到這里吧，歡迎有對OCTA技術感興趣的老師們找我進行溝通咨詢，讓我們一起探索這奇妙的動物實驗吧!
參考文獻Li Y, Rakymzhan A, Tang P, Wang RK. Procedure and protocols for optical imaging of cerebral blood flow and hemodynamics in awake mice. Biomed Opt Express. 2020;11(6):3288-3300. Published 2020 May 26. doi:10.1364/BOE.394649
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