光學相干斷層掃描（OCT）能以細胞尺度分辨率對幾毫米的活體組織進行實時三維成像，但在功能生物學研究方面，仍缺乏可很好與組織區分開來的外源性造影劑從而導致應用受限。基于此，斯坦福大學研究人員Orly Liba等開發了一種功能性OCT成像方法，稱為“MOZART”。該方法使用采用LGNRs（large gold nanorods）作為造影劑并結合特定算法進行光譜識別。LGNRs每粒子的光譜信號比傳統GNR高110倍，使得能夠從水中檢測出單個LGNR，在活小鼠循環中的檢出濃度可低達250 pM。該方法還能夠自適應地補償深度并處理偽像。總的來說，該方法能夠在活體中實現高質量的非侵入性對比增強OCT成像。此外通過不同光譜的LGNR復用可以觀察淋巴引流的離散模式，并識別單個淋巴管和淋巴管瓣膜的功能狀態。研究成果以“Contrast-enhanced optical coherence tomography withpicomolar sensitivity for functional in vivo imaging”為題發表于Scientific Reports。

 背景
 通過使用分子造影劑，正電子發射斷層掃描和光聲成像等技術，活體內功能成像領域取得了一系列重大進展，組織穿透性更好。然而這些技術的空間分辨率仍較差，單個圖像體素可能包含10³-10⁷個細胞。其他成像方式如光學顯微鏡，分辨率很容達到亞細胞水平，但在混濁組織中成像深度不超過幾百微米。因此，迫切需要具有細胞尺度分辨率的功能性體內成像技術。OCT使用低相干的干涉法實現微米級的空間分辨率和毫米級的穿透深度，似乎能填補當前功能成像技術空白。迄今為止，OCT的應用主要集中在組織結構或血流和氧合的研究中。有研究試圖通過使用各種納米粒子將OCT用于分子成像，最常見的是使用金納米棒（GNRs）。但這些傳統粒子的總消光主要是吸收而不是散射，致使OCT對比度較差。而且通常用于生物醫學成像的GNR較小（約50×15 nm），散射不光足以突破內源性組織信號，而大一些的GNR的散射截面會有顯著增加，雖然已經有研究將其用于生物應用，但還處于探索階段。此外這些研究主要在體外進行，背景散射明顯小于真實組織。因此，外源因子的信號對于實現OCT分子成像至關重要，需要能從活體組織的內在信號中區分出來。

 本文旨在證明使用對比增強OCT可以在活體內進行功能成像。根據之前研究，使用大的適用于生物用途的GNRs（約100× 30 nm，即LGNRs）作為OCT造影劑。使用SD-OCT（Spectral Domain OCT）系統和定制的光譜算法，活體內檢測了這些GNR試劑。發現LGNRs每粒子產生的光譜信號是傳統GNR的約110倍，且活體內LGNR檢測靈敏度可達至少250 pM。使用該系統無創成像觀察了腫瘤組織中750 μm深度的小血管（直徑約20 μm），以及小鼠耳淋巴網絡中液體引流的空間模式。除此之外，對比增強型OCT圖像還用來確定維持單向淋巴流動的淋巴管的位置和功能狀態。為體內靶向分子成像研究提供了一個理想的平臺。   圖1 MOZART及其活體內成像能力總覽。（a）傳統OCT掃描小鼠耳廓。（b）MOZART結合使用SD-OCT和造影劑LGNR，以及定制的處理算法，產生的圖像包含體內功能性信息。MOZART圖像以不同光譜展示皮下注射的LGNR，引流到淋巴管為綠色和青色，引流到血管為紅色。

 結果
 01-后處理算法
 OCT依靠低相干光干涉來檢測樣品中散射體的位置，SD-OCT則是通過對獲得的干涉信號光譜進行傅里葉變換來確定散射體位置，這種標準方法產生的圖像帶有純粹的結構信息（圖2a）。研究人員結合定制處理算法，將原始的SD-OCT干涉圖分成兩個光譜不同的子集即Band 1和Band 2，大致對應900-1000 nm和800-900 nm的波長范圍（圖2c）。分別重建兩個子集的干涉圖，從總干涉圖重建的OCT圖像中減去它們并除以OCT圖像。將重建波段之間的差異定義為光譜信號，將重建波段之間的歸一化差異定義為光譜對比度（圖2d）。  

 

圖2 后處理步驟及結果。（a）OCT對數強度圖像，展示IV注射LGNR后耳廓中腫瘤的結構。（b）流動檢測算法結果。圖像中含血管下的垂直陰影，是散斑方差法檢測流動的典型偽影。（c）干涉圖被分成兩個波段，以實現雙波段檢測LGNR。（d）光譜對比度的對數表示。（e）迭代色散補償后的圖d。（f）應用深度相關增益的圖e，以補償深度相關光譜像差。（g）血流檢測與光譜對比度相結合，產生注射LGNR后腫瘤血管的光譜圖。血管中的LGNRs顯示為黃綠色。由于血管下方組織的光譜中性，LGNRs下方區域呈現紅色。（h）圖g結合OCT強度信號以顯示組織解剖結構。
 

在OCT中，當光通過色散介質時，樣品臂和參考臂之間的光程長度不匹配會導致色散，OCT系統中的光學元件和樣品本身也會導致色散。可在后處理圖像重建期間通過添加與波數成平方關系的相位進行色散補償，此外還有光譜偽影，因此研究人員也開發了自適應方法進行相應補償（圖2e，f）。
 

將血流檢測（描繪為圖像強度）與光譜對比度（描繪為圖像色調）相結合，產生血流門控圖像（圖2g）。血流和光譜對比度也與組織結構相結合，實現光譜和功能信息的同時可視化（圖2h）。
 02-LGNR造影劑在OCT中的應用

 本研究合成了一種較大的GNR（LGNR），尺寸約100× 30 nm的LGNR，通過透射電子顯微鏡測量發現，LGNRs在815 nm處顯示出縱向表面等離子體共振（LSPR）峰值，并且消光系數比等效等離子體共振的常規GNRs大約8倍（圖3a）。還制備了另一批925 nm LSPR的LGNRs用于多重研究。
 除光散射強度外，生物穩定性和無毒性也至關重要。研究人員用methoxy-PEG-SH包被LGNRs-PSS，即PSS（poly sodium 4-styrenesulfonate，MW約70 kDa）溫育LGNRs產生的顆粒，在DDI H₂O和FBS中都非常穩定，隨后洗滌以產生LGNRs-PSS-mPEG，確保生物相容性和無毒性。將LGNRs-PSS-mPEG用于所有淋巴成像實驗。還制備了由非特異性IgG1抗體包被的LGNRs-PSS（LGNRs-Ab），用于進一步的分子靶向實驗，同時也證明了LGNRs-PSS的廣泛應用性，可以很容易地用抗體進行修飾。
 為證明LGNR在對比增強型OCT中的顯著優勢，體外比較了LGNR和GNR的OCT信號。使用具有同等LSPR的LGNRs和GNRs，LGNRs每粒子產生的OCT強度比GNRs高約30倍。光譜檢測的使用額外改善了LGNR信號，使得LGNRs顯示出比GNRs大約110倍的光譜信號（p< 0.001，圖3b，c）。LGNRs散射增加的部分原因是它們的橫截面積更大。
 

 

圖3 GNR和LGNR對比的評估。（a）相同的納米粒子濃度（nps/ml）下，LGNRs的總消光比傳統GNR大約8倍。（b）以同等的粒子濃度（1× 10¹⁰ mps/ml）制備時，LGNR的OCT信號比GNR大得多。（c）對b中標出的區域進行的定量分析表明，LGNR的OCT強度比GNR強約30倍，光譜信號比GNR強約110倍（*p< 0.001）。（d）血液中LGNR濃度增加的對數OCT強度。（e）d中樣品的光譜對比度，顯示隨著LGNR濃度的增加，光譜色調從紅色增加到黃綠色。虛線為用于光譜對比度量化的區域。（f）血液中LGNR濃度的光譜對比度的量化。
 

使用本文的光譜處理算法，能夠檢測到水溶液中的單個LGNR（圖2b）。在OCT圖像中觀察到的亮點數量與成像體積中給定LGNR濃度下單個粒子的預期數量一致。
 

 03-體外成像靈敏度

 使用新采集的大鼠全血進行體外成像靈敏度探究，發現使用該系統光譜分析方法檢測LGNR的靈敏度為50 pM（p< 0.001），表明LGNRs容易產生在生物背景中可區分的OCT光譜對比度（圖3d-f）。
  04-活體內LGNR靈敏度和循環時間
 通過對小鼠腫瘤異種移植模型成像，證明該系統在活體內檢測LGNRs的能力。在雌性裸鼠（nu^-/nu^-）右耳耳廓接種U87MG細胞。腫瘤細胞注射后7天，以20 μL的增量靜脈注射LGNRs-Ab（250 μL，濃度23.5 nM），每次注射后獲取截面OCT圖像，并測量血管中的光譜對比度。研究發現，雖然血管最初表現出中性光譜信號，但注射LGNR-Ab后，血管中觀察光譜偏差強烈朝向LGNR-Ab峰（圖4a）。光譜分析能夠檢測小鼠耳脈管系統中低至250 pM（p < 0.001）濃度的LGNRs-Ab（圖4b）。藥代動力學方面，基于注射后24h內的光譜定量，LGNRs-Ab的光譜對比循環半衰期（t_1/2）約為18h（圖4c），因此抗體修飾的LGNRs在分子靶向研究中也有很大的應用潛力。  

 

圖4 體內腫瘤模型中OCT圖像的對比度增強。（a）靜脈注射LGNRs-Ab前后的OCT對數強度圖像和組合光譜對比圖像。在血管中檢測到LGNRs-Ab，注射前為紅色，注射后為黃綠色。LGNRs-Ab增強了觀察腫瘤深處小血管的能力（白色箭頭）。（b）在LGNRs-Ab靜脈遞增注射期間血管中的光譜信號。能夠從第一次增量注射中檢測到LGNRs-Ab，相當于血液中LGNRs-Ab濃度為250 pM（*p< 0.001）。（c）靜脈注射LGNRs-Ab前和注射后24h血管中的光譜信號。（d）注射LGNR-Ab前及注射后0、16、24 h腫瘤血管（白色虛線圈出）和鄰近健康組織中光譜對比信號的3D體積視圖。
  05-腫瘤中的LGNR成像
 體積式OCT圖像顯示，在注射LGNR-Ab前，健康耳組織和腫瘤組織之間的血管形態存在差異，而健康血管系統和腫瘤血管系統的信號在光譜上都是中性的。注射LGNR-Ab后，兩者脈管系統中都觀察到光譜對比度顯著增加，且由于LGNRs-Ab的反向散射增加，還可觀察到許多額外的小血管，特別是在腫瘤內部（圖4d）。
  06-LGNR復用以成像功能性淋巴引流
 有研究使用OCT來識別淋巴管網絡，但無法提供關于功能性淋巴流動的信息，如引流的組織區域或淋巴流動方向。研究人員使用MOZART系統對小鼠耳廓初始淋巴管中液體引流的空間依賴性進行成像。在注射之前采集的流動門控OCT圖像描繪出血管系統（圖5a）。注射815 nm的LGNR-PSS-mPEG（2 μL，濃度8.5 nM）后，立即觀察到廣泛的引流淋巴管網絡，直徑小至約20 μm（圖5b）。30 min后，在距離第一個注射部位約1 mm處注射光譜不同的925 nm LGNRs-PSS-mPEG（2 μL，濃度8.5 nM）。使用光譜分析來區分兩種LGNR，觀察到幾個之前看不到的淋巴管從925 nm LGNR注射部位引流。有趣的是，在第一次注射后顯示出強815 nm LGNR信號的幾個淋巴管在第二次注射后，顯示出925 nm LGNR信號或混合LGNR信號。一些包含混合光譜信號的淋巴管顯示出離散的光譜對比度，而不是兩個LGNR光譜的平均值（圖5c）。
 健康淋巴管功能和哺乳動物免疫中的關鍵是間質液的單向引流和細胞向淋巴結的轉運。淋巴管通過流體壓力和兩端的瓣膜功能保持液體的單向流動。MOZART系統能夠區分出引流網絡中的單個淋巴管（圖5d，e）。多重LGNRs-PSS-mPEG的順序注射也可以推斷淋巴管的功能狀態，是否能維持單向引流。其中單向瓣膜功能的影響非常明顯，不同淋巴管匯集到于此，引流的不同光譜LGNR匯集進入下游淋巴管中（圖5f）。  

 

圖5 LGNRs-PSS-mPEG引流到耳廓淋巴管的活體內研究。（a）流動檢測的正面視圖，顯示注射前的血管（紅色）。（b）光譜對比顯示第一次注射815 nm LGNR（綠色）。（c）第二次注射925 nm LGNR后（青色-藍色）。LGNRs正在填充淋巴管，并從耳邊緣的注射部位（圖像頂部）引流向耳朵底部（圖像底部）。（d）另一只小鼠左側注射815 nm LGNR后的正面圖。（e）d中虛線區域的特寫圖，顯示淋巴網絡中的連接。可以清楚觀察到相鄰淋巴管之間瓣膜的位置（白色箭頭）。（f）與e同一個區域注射925 nm LGNR后。815 nm和925 nm LGNRs都到達淋巴連接。連接處左側的淋巴管仍含有815 nm LGNR（綠色），而右側以前未發現的淋巴管和連接處下游的淋巴管顯示925 nm LGNR（青色-藍色）。

 結論
 本研究使用的對比增強型OCT成像平臺，即MOZART，在小動物中實現了活體功能性成像研究。其中的LGNR造影劑功能化方便且靈敏度高，自適應光譜處理算法可以實現無相差、高對比度的OCT體內研究。此外LGNR復用實現了對淋巴引流的可視化，能夠觀察到淋巴網絡中單獨淋巴管以及淋巴瓣膜的功能狀態。證明該平臺在體內分子研究中的良好應用性，在臨床前研究中，該平臺可用于研究分子腫瘤異質性及淋巴管網絡等。此外也有專門用于視網膜成像的OCT儀器，因此該平臺也可用于研究視網膜疾病。

 

參考文獻

Liba, Orly , et al. "Contrast-enhanced optical coherence tomography with picomolar sensitivity for functional in vivo imaging." Scientific Reports 6(2016):23337.