體外培養的血管內皮細胞已廣泛應用于血管疾病、血管修復、腫瘤血管形成等基礎研究及臨床研究中。體外培養的血管內皮細胞，仍可保持血管內皮細胞的特征，如表達VIII因子、懷布爾－帕拉德小體(Weibel-Palade body ) 、內皮細胞特異性抗原和IV 型膠原等，還可在三維培養體系或特定誘導條件下形成血管樣結構。體外培養的血管內皮細胞生長形成單層后，會表現出接觸抑制和密度限制，將停止生長。人們已成功培養了牛主動脈內皮、人臍靜脈內皮、腦微血管、肺微血管、肝竇微血管及各種腫瘤組織中的血管內皮細胞。下面小海星就來介紹下最常用的人臍靜脈血管內皮細胞的培養。
 

1. 設備  超凈工作臺、離心機、水浴鍋、CO2培養箱、－10℃ 冰箱、－20℃冰箱。

2. 無菌材料  大培養皿、止血鉗、靜脈插管、500ml 大燒杯、消毒的蒸餾水、50ml 離心管、刻度吸管、彎頭吸管、T25 培養瓶、廣口試劑瓶、臍帶(1根）、保鮮液(0.01% EDTA/DMEM, 4℃儲藏）、高糖DMEM 培養液、胎牛血清、青／鏈霉素、D-Hanks 溶液、I 型膠原酶、VEGF 或ECGS 。
 

二、操作流程

1. 產科無菌取臍帶1 根， 置于含保鮮液的廣口試劑瓶中4℃保存（避免污染），在最短的時間內，將臍帶攜入實驗室，進行以下操作。

2. 在超凈工作臺或無菌層流工作臺上，將臍帶用D-Hank 溶液清洗干凈，將靜脈插管插入臍靜脈中，并用絲線結扎、固定。

3. 用20ml 注射器將37℃ 的D-Hanks 溶液注入臍靜脈，反復沖洗至清洗液無色澄清為止。

4. 用血管鉗夾住臍靜脈的另一端，并將0.2％的Ⅰ型或Ⅱ 型膠原酶（約20ml) 通過靜脈插管注入臍靜脈中， 至臍靜脈完全充盈為止（排掉靜脈管中的空氣）。

5. 將臍帶放置在盛有37℃水的玻璃燒杯中，在37°C 水浴條件下消化約20min（每5min 抽吸／注入1 次）。

6. 當酶液變成混濁時（在顯微鏡下可見大量游離細胞），將酶液在臍靜脈中反復抽吸沖打3 次后，吸出并置于50ml 離心管中。

7. 細胞懸液經350g 離心5min 后，棄去上清液，并用D-Hanks 溶液清洗2次，然后再以350g 離心5min 。

8. 棄去上清液，將細胞溶于8ml 內皮細胞培養液(M l99 80ml、FBS 20ml 、PS 1ml 、L-Gln 2mM、ECGS 10mg/100ml 、Heparan 4000U/1 00ml 、Insulin mu/100ml)中，接種于預先包被2％明膠的T25 培養瓶中。

9. 細胞培養在37℃ 、5% CO2培養箱中， 24h 后換液，棄掉未貼壁細胞。之后每2~3d 換液1 次， 待細胞匯合時消化傳代。
 

體外培養成功的細胞，需進行純度鑒定。可提供檢測其特性來鑒定，如表達Ⅷ 因子、Weibel-Palade 小體，攝取乙酰化低密度脂蛋白，表達內皮細胞特異性抗原CD31 等。
 

四、提 示

培養的臍靜脈內皮細胞是使用最規范的體外血管內皮細胞模型。其培養已較成熟。但由于其傳代有限，往往需不斷重復培養。另外，培養臍靜脈內皮細胞時，最好能添加VEGF 或ECGS, 以刺激血管內皮細胞增殖，可增加傳代數，獲得較多的血管內皮細胞用于研究。
 

五、培養注意要點

1. 永生化的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）培養注意要點：

（1）該細胞為有限傳代細胞系，在體外培養可傳20代。請注意代次控制;

（2）該細胞培養難度較高，建議使用專用培養基。

2. 永生化的人臍靜脈內皮培養體系：內皮細胞基礎培養基＋5% FBS＋1%內皮細胞培養添加劑+1% P/S。

推薦使用海星人臍靜脈內皮細胞完全培養基，貨號：TCH-G406。

3. 如選擇使用其它品牌培養基，可選：

（1）內皮細胞基礎培養基推薦：ScienCell（Cat.No.1001）

基本成分介紹：永生化的人臍靜脈內皮培養體系是專門為血管內皮細胞體外培養設計的最適于其生長的完全培養基。包含必需和非必需氨基酸、維生素、有機和無機化合物、激素、生長因子、微量礦物質和低濃度胎牛血清(5%)。該培養基的配方能夠選擇性的促進正常血管內皮細胞體外培養中的增殖和生長，并為其達到最理想營養平衡狀態。

（2）胎牛血清推薦：HyCyte™干細胞預篩選胎牛血清 （Cat.No.FBP-S001）

基本成分介紹：適用于有較高要求的細胞和較難獲得的細胞，如血管內皮細胞。

（3）內皮細胞培養添加劑推薦：ScienCell（Cat.No.SC1052)

基本成分介紹：內皮細胞培養添加劑(ECGS)是一種從牛腦垂體提取的培養基補充劑，含有培養血管內皮細胞所必需的生長因子、激素和蛋白質。該補充劑最大限度地促進永生化的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的生長，該因子的添加對維持永生化的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）形態至關重要。

注意：

請務必使用以上兩種推薦培養體系進行永生化的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的培養，否則可能導致細胞無法增殖。

T25瓶細胞由于運輸過程影響細胞會分泌產生的少量小黑點，不是污染問題，屬正�，F象，使用專用培養體系進行培養后黑點會逐步減少。

永生化的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）對血清的品質要求較高，請使用高品質胎牛血清進行培養。如細胞狀態欠佳，建議將胎牛血清的濃度提高到10%。