轉錄組測序：細胞核絲狀肌動蛋白組織在卵巢癌中的潛在機制的研究
近日，復旦大學青年研究員鄭義艷團隊在期刊Frontiers in Cell and Developmental Biology（IF：6.081）上發表了題為Investigation of the Potential Mechanisms Underlying Nuclear F-Actin Organization in Ovarian Cancer Cells by High-Throughput Screening in Combination With Deep Learning的研究論文，在卵巢癌中報道了絲狀肌動蛋白的潛在機制。該研究中的轉錄組測序由上海生物芯片有限公司（生物芯片上海國家工程研究中心）完成。
研究內容
絲狀肌動蛋白（F-actin/F-肌動蛋白）和球狀肌動蛋白存在于體細胞的細胞核中，并參與了染色質重塑、基因轉錄調控和DNA損傷修復。然而，細胞核F-肌動蛋白在細胞中聚合的潛在機制仍未得到完全理解。此研究使用小分子抑制劑庫篩選并結合了深度學習的方法，確定了參與卵巢癌細胞核F-肌動蛋白聚合的潛在激酶靶點。研究中使用的抑制劑的靶點分析表明，PI3K-AKT通路參與調控卵巢癌細胞中細胞核F-肌動蛋白組織。此研究為揭示核F-肌動蛋白在卵巢癌中的重要作用以及理解核F-肌動蛋白結構是如何組織的奠定了基礎。
文章詳情
文章題目：Investigation of the Potential Mechanisms Underlying Nuclear F-Actin Organization in Ovarian Cancer Cells by High-Throughput Screening in Combination With Deep Learning
中文題目：通過高通量篩選結合深度學習來研究細胞核絲狀肌動蛋白組織在卵巢癌中的潛在機制
發表時間：2022.05
期刊名稱：Frontiers in Cell and Developmental Biology
影響因子：6.081
DOI：10.3389/fcell.2022.869531
研究思路
- 卵巢癌細胞中核F-肌動蛋白結構的特征分析
研究者以卵巢癌為模型，研究細胞核F-肌動蛋白是否存在于癌細胞中。研究者制備了多種穩定表達nAc-citrine的卵巢癌細胞系。nAc(核肌動蛋白染色體)是核肌動蛋白結合探針，其可與熒光標簽citrine熔合。利用該探針，研究者在不同卵巢癌細胞系中檢測了細胞核中的F-肌動蛋白，不同細胞系表達核F-肌動蛋白的細胞比例不同(圖1A-C)。尤其在OVCA432-nAc-citrine細胞中核F-肌動蛋白的占比可達到約70%(圖1C)。在其他細胞系中，如HEY-nAc-citrine中核F-肌動蛋白的占比很少(圖1C)。研究者進一步分析了卵巢癌細胞株OVCA432中核肌動蛋白絲的數量、厚度和長度(補充圖S1A-C)。隨后他們進行了z-slice分析，結果證實了nAc-citrine細胞核內結合了F-肌動蛋白 (圖1D)。此外，層蛋白A/C染色顯示F-肌動蛋白結構沒有延伸出核膜(圖1E)。這些分析表明，F-肌動蛋白組裝發生在卵巢癌細胞系的細胞核中。并且在沒有nAc-citrine表達的SKOV3細胞系中，通過phalloidin染色證實了核F-肌動蛋白的存在(圖1F)，表明獲得的核F-肌動蛋白信號不是nAc-citrine標記和/或異位表達的偽信號。為了研究nAc-citrine的過表達是否有助于調控卵巢癌細胞系的基因表達，研究者對OVCA432-nAc-citrine和OVCA432細胞進行了Bulk RNA測序來比較他們的轉錄譜。飽和度分析顯示，OVCA432- nAc -citrine細胞和OVCA432細胞具有相似的曲線(補充圖S1D)，說明這兩種細胞的總RNA質量相似。同時，OVCA432-nAc-citrine與OVCA432之間的差異表達基因非常少(補充圖S1E)，說明過表達nAc-citrine不可能在整體水平上重塑基因表達。這表明，在卵巢癌細胞系中使用nAc-citrine探針標記核F-肌動蛋白是可行的。
為了進一步研究三維培養物中的核F-肌動蛋白組織，研究者生產了SKOV3細胞的球狀體，其穩定地表達lifeact（F-肌動蛋白結合探針），并與熒光標簽citrine融合。在3D培養中，他們檢測到明顯的核F-肌動蛋白結構(圖1G,H)。為了進一步表征核F-肌動蛋白組織的新生特征，他們又對SKOV3-nAc-citrine細胞進行了活細胞成像，并記錄了核中F-肌動蛋白的動態變化，結果顯示核F-肌動蛋白結構的形成不是暫時的(補充 Videos S1-S3，此處未列出)。
對卵巢癌細胞系中核F-肌動蛋白組織的分析促使研究者在卵巢癌患者的腫瘤細胞中檢查這些結構的存在。在細胞核F-肌動蛋白染色前，PAX8免疫熒光證實了新鮮冷凍腫瘤切片中存在卵巢癌細胞(補充圖S2A)。具有代表性的圖像顯示，高級別漿液性卵巢癌患者的腫瘤細胞中存在核F-肌動蛋白(圖1I,J)。研究者使用z-slice分析進一步證實這些F-肌動蛋白結構存在于細胞核內(圖1K,L)。隨后研究者使用Imaris通過一系列phalloidin染色連續圖像重建了細胞核內F-肌動蛋白結構的3D模型，其中具有代表性的圖像如圖1I,J所示。再次證實了細胞核內明顯可見F-肌動蛋白組織(圖1M and 補充Video S4，Video此處未列出)。此外，他們使用同一卵巢癌患者的另一個腫瘤切片在癌細胞中發現了這些核F-肌動蛋白結構(補充圖S2B-E)。
- 卵巢癌細胞中調節核F-肌動蛋白組裝的激酶的鑒定
為了解剖卵巢癌細胞中核F-肌動蛋白聚合的機制，研究者重點關注激酶靶點。他們利用商業小分子抑制劑庫TargetMol和高通量篩選系統(High-Content Screening system, HCS)在卵巢癌細胞中尋找參與核F-肌動蛋白組織的潛在激酶靶點。由于OVCA432-nAc-citrine細胞系在細胞核中具有顯著的F-肌動蛋白結構，他們使用來自TargetMol文庫的單個小激酶抑制劑處理這些細胞，該文庫包含1247個小分子抑制劑。篩選流程如圖2A所示。研究者選擇BMS3（其可靶向LIMK激酶）作為陽性對照進行高通量篩選。總共產生了大約38000張圖像的數據集。代表性圖像如圖2B所示，表明BMS3和UM164的小分子能夠抑制OVCA432-nAc-citrine細胞中核F-肌動蛋白聚合。
接下來，研究者開發了一個深度學習渠道，使用人工智能框架分析帶有核F-肌動蛋白的OVCA432 - nAc -citrine細胞(圖2C)。此研究使用的深度學習模型基于YOLOv5, YOLOv5是YOLO系列的最新版本。在該模型中，利用框架的焦點層來降低模型的權重。在使用標注的細胞進行訓練和驗證的環節中(圖2C)，對總細胞檢測的準確率為0.958，召回率為0.891，對核F-肌動蛋白細胞檢測的準確率為0.917，召回率為0.904。重要的是，將未標注的細胞隨機分配給人工計數總細胞或核F-肌動蛋白細胞，結果與深度學習模型一致。因此，該模型是一個可行的工具，以支持進一步的圖像分析在高通量水平。該模型的應用使研究者能夠識別調控卵巢癌細胞中核F-肌動蛋白組織的小分子抑制劑(圖3A)。研究者匯集了小分子抑制劑，使細胞核F-肌動蛋白含量降低20%以上的細胞，或使細胞核F-肌動蛋白含量提高15%以上的細胞。這些抑制劑的激酶靶點見補充圖S3A,B。然后，他們使用這些激酶靶點進行KEGG通路富集分析。這表明PI3K-AKT可能參與卵巢癌細胞中核F-肌動蛋白組織(圖3B)。為了進一步證實這一點，研究者選擇了所有具有深度學習算法特征的激酶，因為它們可以重塑核F-肌動蛋白結構。36種抑制劑被證明與PI3K-AKT通路相關，其中23種抑制劑具有抑制核F-肌動蛋白聚合的作用，而其他13種抑制劑則具有促進核F-肌動蛋白聚合的作用。隨后，他們使用這36種抑制劑處理OVCA432-nAc-citrine細胞，同時DMSO作為陰性對照，BMS3作為陽性對照。結果顯示：下調組的21種抑制劑和上調組的4種抑制劑對核F-肌動蛋白組織的調節作用一致(圖3C,D)。因此，研究者確信PI3K-AKT通路在核F-肌動蛋白形成中發揮重要作用。
主要結論
此研究揭示了F-肌動蛋白存在于卵巢癌細胞系的細胞核中，更重要的是，此研究在新鮮冷凍腫瘤切片中揭示了核F-肌動蛋白的組織。卵巢癌的一線治療是細胞修復手術結合化療藥物，包括鉑類藥物。由于鉑類藥物通過連接DNA堿基誘導卵巢癌細胞的DNA損傷，因此檢測核F-actin是否參與卵巢癌細胞的DNA損傷修復，以及這些結構在卵巢癌的背景下是否具有臨床意義將是十分重要的。
參考文獻
Wu W, Xing X, Wang M, Feng Y, Wietek N, Chong K, El-Sahhar S, Ahmed AA, Zang R, Zheng Y. Investigation of the Potential Mechanisms Underlying Nuclear F-Actin Organization in Ovarian Cancer Cells by High-Throughput Screening in Combination With Deep Learning. Front Cell Dev Biol. 2022 May 26;10:869531. doi: 10.3389/fcell.2022.869531. PMID: 35693931; PMCID: PMC9178185.
