CRISPR-Cas9技術

前沿
在現代生物科技領域，CRISPR-Cas9技術已經成為最受歡迎的基因編輯工具之一。這種技術可以用來研究基因功能，疾病診斷和治療等方面。其中最常用的應用就是構建基因敲除細胞模型。

本文將介紹CRISPR技術的基本原理和操作流程，以幫助您更好地了解和使用這種重要的基因編輯工具。

一、CRISPR技術的基礎原理

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技術最初是從大腸桿菌中發現的一種天然的細菌防御系統，后來被發現可以被用于基因編輯。

CRISPR-Cas9技術基于一種叫做“RNA導向”的機制（guide RNA, gRNA），這種機制可以讓CRISPR-Cas9系統選擇性地識別和切割DNA中的特定序列。

這意味著我們可以使用CRISPR-Cas9來精確地編輯細胞中的基因序列，包括基因敲除、插入、替換等等。
 

二、操作流程

CRISPR-Cas9技術的操作流程分為四個主要步驟：設計gRNA、構建質粒、轉染細胞、鑒定細胞。

1.設計gRNA：gRNA是由CRISPR-Cas9系統識別并切割目標DNA的關鍵部分。我們需要在目標基因中選擇一個合適的靶點序列，設計gRNA來引導Cas9蛋白識別并切割該序列。

耐思開發的Quick-KO®基因敲除試劑盒根據已知的人和小鼠編碼基因，采用優化的預設計方案，相較于傳統方案具有更高的敲除效率。
 

2.構建質粒：質粒是攜帶CRISPR-Cas9系統和gRNA的載體。在構建質粒時，我們需要將Cas9基因和gRNA序列克隆到質粒中，并確保它們可以在細胞中穩定表達。

耐思Quick-KO®基因敲除試劑盒中的Cas9質粒和gRNA質粒分別攜帶Blasticidin和Puromycin/mCherry篩選標記，方便用戶進行陽性細胞富集。

3.轉染細胞：將質粒轉染到目標細胞中，讓它們表達CRISPR-Cas9系統并編輯目標基因。轉染可以通過電穿孔或者化學轉染的方法進行。

此外，針對轉染效率低的細胞，也可以選擇慢病毒款的耐思Quick-KO®基因敲除試劑盒。

4.鑒定細胞：最后一步是對成功轉染的細胞進行篩選，通過PCR和測序的方法，篩選出具有目標基因敲除的細胞。

三、目標細胞類型

CRISPR技術可以用于多種細胞類型的編輯，包括哺乳動物細胞、酵母菌、昆蟲細胞和植物細胞等。

其中，人類細胞是最常用的細胞模型之一，可以用于疾病模型的構建、藥物篩選和基礎研究等方面。

耐思Quick-KO®基因敲除試劑盒主要針對人類細胞、小鼠細胞等哺乳動物細胞開發。



對于不同的目標細胞類型，我們需要根據細胞的特點和CRISPR技術的限制來選擇合適的CRISPR-Cas9系統和轉染方法。
 

基因敲除細胞模型的構建對于基礎研究和藥物研發等領域具有重要的意義。

CRISPR技術的出現為基因編輯提供了一種高效、精準和經濟的方法。在使用CRISPR-Cas9技術進行基因敲除時，我們需要選擇合適的gRNA和基因遞送方法，最終獲得目標基因敲除的細胞模型。