細(xì)胞凋亡檢測試劑盒使用指南及注意事項
檢測原理
用于檢測細(xì)胞凋亡早期的發(fā)生。
PS正常分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè),即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期,不同類型的細(xì)胞都會把PS外翻到細(xì)胞膜外側(cè)。用帶有FITC標(biāo)記的Annexin V,即Annexin V-FITC,就可以通過流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測到PS外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。
碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一種可對DNA染色的細(xì)胞核染色試劑,在嵌入DNA后釋放紅色熒光。PI不能穿透完整的細(xì)胞膜,但可以穿透壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞。因此,將Annexin V與PI聯(lián)合使用時,PI被排除在活細(xì)胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI-)外,而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時被FITC和PI結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性(Annexin V+/PI+)。
FITC最大吸收波長為490nm,發(fā)射波長為525nm,PI-DNA復(fù)合物的最大吸收和發(fā)射波長分別為535nm和615nm。
使用方法
01.樣品染色
1. 將Binding buffer(10×)稀釋成1×Binding buffer工作液備用(1 mL Binding buffer(10×)需加入9 mL無菌去離子水)。2. 對于懸浮細(xì)胞, 500-1000×g 離心 5min 收集細(xì)胞。
對于貼壁細(xì)胞, 要用不含 EDTA 的胰酶消化細(xì)胞, 胰酶消化時間不宜過長或過短,最好是在輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時,加入細(xì)胞培養(yǎng)液,將細(xì)胞輕輕吹打下來,轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi), 500-1000×g離心5min收集細(xì)胞。
3. 收集細(xì)胞后,加入預(yù)冷PBS溶液輕搖或用移液器輕柔吹打洗滌,離心收集細(xì)胞,共洗滌兩次。
4. 在細(xì)胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液,重懸細(xì)胞,使細(xì)胞濃度達(dá)到 1×10^6 cell/mL。
5. 吸取100μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞總數(shù)為 1×10^5 cell)至一新管中,加入5μL Annexin V-FITC 和 5-10μL PI,輕輕混勻,室溫避光孵育15min。
02.樣品檢測
建議設(shè)置正常細(xì)胞、PI單染和 Annexin V-FITC 單染3個對照組,正常細(xì)胞組可作為熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。若十字門的位置不易設(shè)定,可采用經(jīng)凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行設(shè)定。結(jié)果可用CellQuest等軟件進(jìn)行分析,繪制雙色散點圖(two-color dot plot),FITC為橫坐標(biāo),PI為縱坐標(biāo)。Annexin V-FITC和PI聯(lián)合使用時,活細(xì)胞僅有很低強度的背景熒光,早期凋亡細(xì)胞僅有較強的綠色熒光,晚期凋亡細(xì)胞有綠色和紅色雙重?zé)晒狻?br /> 2. 熒光顯微鏡檢測：染色孵育后涂片,顯微鏡下觀察。使用熒光顯微鏡上的藍(lán)光和綠光通道分別觀察FITC和PI。被Annexin V-FITC結(jié)合的細(xì)胞顯示漿膜上有綠色光環(huán)。喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞,細(xì)胞核顯示紅色,膜上有綠色光環(huán)。
注意事項
1. 可立式離心管內(nèi)試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底,避免開蓋時液體灑落。
2. Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)是光敏物質(zhì),在保存與操作時請注意避光。
3. 在細(xì)胞洗滌的最后一步,請盡量將上清棄凈,以免PBS殘留影響實驗結(jié)果。
4. 為獲得準(zhǔn)確試驗結(jié)果,建議樣品在染色后1小時內(nèi)進(jìn)行分析。
5. 為了您的安全和健康,請穿戴實驗防護(hù)服、手套、口罩等必要的防護(hù)裝備。
- 細(xì)胞培養(yǎng)時造成“黑膠蟲”及“黑點”污染的現(xiàn)象分析及原因總結(jié)
- 原代細(xì)胞分離培養(yǎng)實驗步驟及注意事項盤點
- 動脈粥樣硬化(AS)進(jìn)程中脂質(zhì)代謝與巨噬細(xì)胞極化的相互作用關(guān)系研究
- T細(xì)胞中免疫檢查點受體信號通路的特征及傳導(dǎo)機制
- 細(xì)胞死亡形式的基本機制及其對應(yīng)的標(biāo)志物簡要介紹
- 細(xì)胞轉(zhuǎn)染的途徑及影響轉(zhuǎn)染試驗的因素
- NK細(xì)胞在肝細(xì)胞癌（HCC）治療中的應(yīng)用優(yōu)勢及案例分享
- 影響干細(xì)胞分化的內(nèi)源性信號通路、環(huán)境影響及表觀遺傳調(diào)控
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com