“長(zhǎng)生不老”一直是神話故事、電影小說(shuō)里必不可少的題材。從幾千年前的秦始皇百煉丹，到現(xiàn)在科學(xué)家們探索和研究，無(wú)一不展現(xiàn)了人類對(duì)于抵抗衰老的執(zhí)著以及對(duì)衰老背后秘密的渴求。到底是怎么樣的機(jī)制調(diào)控衰老，我們又是否可以突破時(shí)間的牢籠…本文以細(xì)胞衰老的不同類型和檢測(cè)方法，為大家介紹目前研究已經(jīng)觸及到的細(xì)胞衰老的秘密。

衰老（Senescence），來(lái)自拉丁語(yǔ)senex，是指在對(duì)各種應(yīng)激反應(yīng)后細(xì)胞發(fā)生不可逆的生長(zhǎng)停滯，同時(shí)伴隨功能的失調(diào)。我們有理由認(rèn)為人類的衰老至少有一部分是由于細(xì)胞衰老引起的，想在人體內(nèi)進(jìn)行研究是幾乎不可能的，但是細(xì)胞水平的變化我們是可以把控的。最早對(duì)于細(xì)胞衰老的定義是基于倫納德·海夫利克對(duì)人類胚胎成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)，他發(fā)現(xiàn)其增殖到50代左右便終止增殖，即以永久性增殖停滯為顯著特征。大部分物種正常體細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)都不能無(wú)限分裂，在分裂一定的次數(shù)后處于靜止?fàn)顟B(tài)，而這個(gè)次數(shù)也被稱為“海夫利克極限”。

衰老的分類

在整個(gè)生命過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)遇到外源性和內(nèi)源性的刺激。根據(jù)細(xì)胞類型、刺激性質(zhì)和強(qiáng)度，細(xì)胞會(huì)選擇三種途徑：修復(fù)、死亡或衰老。基于應(yīng)激發(fā)生的細(xì)胞衰老可分為復(fù)制性衰老（端粒）和應(yīng)激過(guò)度的早衰，不同類型的刺激誘導(dǎo)細(xì)胞的衰老具有相同的衰老表型（如圖1）。

圖1 不同的壓力源導(dǎo)致的細(xì)胞衰老[1]
 

 復(fù)制性衰老

在目前的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞衰老可以用細(xì)胞的群體倍增次數(shù)來(lái)量化（注：群體倍增次數(shù)（population doubling (PD or pd) number）是細(xì)胞種群數(shù)量翻倍的近似數(shù)。例如，當(dāng)傳代的細(xì)胞分裂比例為1:2時(shí)，傳代數(shù)與PD數(shù)相等；傳代的細(xì)胞分裂比例為1:4時(shí)，傳代數(shù)等于2 PDs，以此類推）。細(xì)胞的類型、種類和供體年齡都是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中影響群體倍增數(shù)量的決定因素。端粒是覆蓋在染色體末端的重復(fù)DNA序列，保護(hù)DNA不被降解或重組，從而維持基因組穩(wěn)定。由于DNA聚合酶無(wú)法復(fù)制DNA的末端，所以端粒會(huì)隨著復(fù)制的次數(shù)增加而逐步被侵蝕，導(dǎo)致端粒達(dá)到臨界長(zhǎng)度，從而觸發(fā)DNA損傷，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程并誘發(fā)衰老。因此解決端粒的縮短可能可以作為人類抗衰老的方法。

圖2 端粒結(jié)構(gòu)示意圖（圖源網(wǎng)絡(luò)）

 

 應(yīng)激誘導(dǎo)的早衰

除復(fù)制性衰老，還有一系列非端粒的刺激因素導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)早衰老，且與端粒的長(zhǎng)度無(wú)關(guān)。“早衰”即指在復(fù)制衰老發(fā)生的最大群體倍增次數(shù)之前，衰老就已經(jīng)出現(xiàn)，即衰老的進(jìn)程發(fā)生了加速。這些應(yīng)激包括內(nèi)源性和外源性，包括活性氧（ROS）產(chǎn)生的氧化應(yīng)激、基因毒性應(yīng)激和癌基因的過(guò)度激活等。端粒體內(nèi)外應(yīng)激的重要靶點(diǎn)，相比于氧化應(yīng)激和基因毒性應(yīng)激，癌基因誘導(dǎo)的衰老不影響端粒的長(zhǎng)度，即不喪失復(fù)制潛能。

 

 細(xì)胞衰老的標(biāo)志物分析

衰老細(xì)胞會(huì)與正常細(xì)胞在某些方面表現(xiàn)出一定的差異性（如圖3），我們可以通過(guò)不同的方法進(jìn)行體外鑒定。沒(méi)有任何標(biāo)志物是衰老細(xì)胞特有的，也不是所有的衰老細(xì)胞都表達(dá)所有的細(xì)胞衰老標(biāo)志物。

圖3 細(xì)胞衰老的特征[1]
 

 BrdU 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

5-溴-脫氧尿嘧啶核苷 (Bromodeoxyuridine，BrdU)是一種胸腺嘧啶核苷的類似物。當(dāng)細(xì)胞處于細(xì)胞周期中的 DNA 合成期 (S 期) 時(shí)，BrdU 可以摻入到新合成的 DNA 中。利用抗 BrdU 的單克隆抗體熒光染色，就可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) BrdU 的含量，從而定量細(xì)胞群體的增殖情況。細(xì)胞衰老的一個(gè)重要標(biāo)志是細(xì)胞周期的穩(wěn)定停滯G1/S期，因此BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高的檢測(cè)細(xì)胞增殖活力的方法。

 知識(shí)小貼士：細(xì)胞周期的介紹  

細(xì)胞周期（cell cycle）是指細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。間期又分為三期，即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。細(xì)胞的生命開(kāi)始于產(chǎn)生它的母細(xì)胞的分裂， 結(jié)束于它的子細(xì)胞的形成，或是細(xì)胞的自身死亡。通常將子細(xì)胞形成作為一次細(xì)胞分裂結(jié)束的標(biāo)志，細(xì)胞周期是指從一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞開(kāi)始到下一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞為止所經(jīng)歷的過(guò)程。在這一過(guò)程中，細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制并均等地分配給兩個(gè)子細(xì)胞。     

圖4 細(xì)胞周期（圖源網(wǎng)絡(luò)，僅供參考）

 

● G1期（first gap）從有絲分裂到DNA復(fù)制前的一段時(shí)期，又稱合成前期，此期主要合成RNA和核糖體。該期特點(diǎn)是物質(zhì)代謝活躍，迅速合成RNA和蛋白質(zhì)，細(xì)胞體積顯著增大。這一期的主要意義在于為下階段S期的DNA復(fù)制作好物質(zhì)和能量的準(zhǔn)備。

● S期（synthesis）即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同時(shí)還要合成組蛋白。DNA復(fù)制所需要的酶都在這一時(shí)期合成。

● G2期（second gap）為DNA合成后期，是有絲分裂的準(zhǔn)備期。在這一時(shí)期，DNA合成終止，大量合成RNA及蛋白質(zhì)，包括微管蛋白和促成熟因子等。

 

 衰老相關(guān)β-半乳糖甘酶

β-半乳糖苷酶，一種廣為人知的衰老標(biāo)志物，簡(jiǎn)直就是“C位大咖”。1995年，Dimiri等人發(fā)現(xiàn)，除了在pH 4.0的條件下可以檢測(cè)到溶酶體的β-半乳糖苷酶，老化的細(xì)胞還會(huì)在pH 6.0檢測(cè)到β-半乳糖苷酶，稱為衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶（Senescence-Associated β-galactosidase ，SA-β-gal）。

圖5 β-半乳糖苷酶檢測(cè)細(xì)胞衰老情況（圖源網(wǎng)絡(luò)）

 

常規(guī)細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒是一種基于衰老時(shí)SA-β-gal活性水平上調(diào)而對(duì)衰老細(xì)胞或組織進(jìn)行染色檢測(cè)的試劑盒，以X-Gal（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）為底物，在pH 6.0條件下，衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化會(huì)生成藍(lán)綠色產(chǎn)物，從而在光學(xué)顯微鏡下觀察到變成藍(lán)色的表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞或組織。一般不會(huì)染色衰老前的細(xì)胞、靜止期細(xì)胞、永生細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞等。

研究表明，SA-β-gal的表達(dá)與溶酶體體積和數(shù)量的增加密切相關(guān)。脂褐素（lipofuscin），是溶酶體作用后不再能被消化的物質(zhì)而形成的殘余體。已經(jīng)有試驗(yàn)驗(yàn)證，脂褐素組織化學(xué)蘇丹黑B（Sudan Black B，SBB）模擬物標(biāo)記染色與SA-β-gal在衰老細(xì)胞中具有共定位的效果，是衰老細(xì)胞體外檢測(cè)另一種指標(biāo)。

值得注意的是，并不是所有細(xì)胞的衰老都表達(dá)SA-β-gal，比如GM1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥是β-半乳糖苷酶缺乏而引起的一種遺傳性溶酶體疾病，其患者的成纖維細(xì)胞在衰老狀態(tài)不表達(dá)SA-β-gal。

 

 衰老相關(guān)的異染色質(zhì)

異染色質(zhì)（heterochromatin）是指在細(xì)胞周期中具有固縮特性的染色體。衰老的開(kāi)始會(huì)產(chǎn)生不同染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的積累，稱為衰老相關(guān)的異染色質(zhì)病灶（senescence associated heterochromatin focal SAHF）。衰老細(xì)胞的DNA包含異染色質(zhì)的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)域，很容易與非衰老細(xì)胞的染色質(zhì)進(jìn)行區(qū)分。

染色質(zhì)重組與衰老相關(guān)的異染色質(zhì)病灶（SAHF）形成和持續(xù)性 DNA 損傷可用于鑒定衰老細(xì)胞。

圖6 常規(guī)和異常染色質(zhì)的區(qū)別（圖源網(wǎng)絡(luò)）

SAHF 的標(biāo)志物可以通過(guò)DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料檢測(cè)，或者相關(guān)蛋白比如異染色質(zhì)蛋白 1（HP1） 和 賴氨酸 9 二或三甲基化組蛋白 H3（H3K9Me2/3） 等進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。盡管SAHF在衰老時(shí)經(jīng)常觀察到，但一些細(xì)胞出現(xiàn)衰老時(shí)并不形成SAHF。

核纖層蛋白B1（Lamin B1）是核纖層蛋白家族重要成員之一，其主要功能在于維持細(xì)胞核骨架完整性，并通過(guò)影響染色體分布、基因表達(dá)及DNA損傷修復(fù)等參與細(xì)胞的增殖和衰老，其表達(dá)量的下調(diào)是細(xì)胞衰老的另一個(gè)重要特征。 

圖7 核纖層蛋白BI免疫熒光結(jié)果（圖源網(wǎng)絡(luò)）

 

 衰老相關(guān)分泌表型

衰老細(xì)胞會(huì)分泌大量的因子，包括促炎細(xì)胞因子和趨化因子、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、血管生成因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等，統(tǒng)稱為衰老相關(guān)分泌表型（Senescent Associated Secretory Phenotype, SASP）。SASP是衰老細(xì)胞的另一個(gè)典型標(biāo)志之一，它介導(dǎo)了許多衰老細(xì)胞的病理生理效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞與周圍環(huán)境的交流，最終影響衰老細(xì)胞的命運(yùn)。

圖8 細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型（圖源網(wǎng)絡(luò)）

在細(xì)胞衰老進(jìn)程中，SASP的分泌是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程, 可分為以下三個(gè)階段：第一階段在DNA損傷后立即開(kāi)始，并持續(xù)36 h，但不足以導(dǎo)致衰老；第二階段是“早期”SASP的形成，在誘發(fā)細(xì)胞衰老后數(shù)天，開(kāi)始出現(xiàn)最重要的SASP因子，例如IL-1α；第三階段是“成熟”SASP的形成，在接下來(lái)的4~10天內(nèi)，通過(guò)正反饋回路對(duì)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，使大多數(shù)因子的分泌增加，最終形成“成熟”的SASP。

圖9 細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型的變化情況（圖源網(wǎng)絡(luò)）

 

目前已有很多SASP相關(guān)的研究，且對(duì)SASP調(diào)節(jié)途徑的研究不斷豐富。但仍需在SASP通路、分子之間的內(nèi)在聯(lián)系，以及SASP影響衰老及衰老相關(guān)疾病的具體機(jī)制等開(kāi)展大量研究。

 

 基因表達(dá)的改變

在細(xì)胞衰老過(guò)程中，基因表達(dá)會(huì)發(fā)生極端變化，尤其是細(xì)胞周期抑制和細(xì)胞周期激活的相關(guān)基因。細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDKs）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）是整個(gè)細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制中的核心分子，衰老細(xì)胞中Cyclins的相關(guān)基因表達(dá)會(huì)被抑制，而CDKs會(huì)被過(guò)度表達(dá)。因此，這些基因表達(dá)的是衰老細(xì)胞的常見(jiàn)標(biāo)志。

例如p21能夠與一種細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、某幾種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)——比如CDK2，CDK4或CDK6構(gòu)成復(fù)合體，抑制CDK的激酶（磷酸化酶）活性，細(xì)胞周期從而被阻礙在G1期而不能進(jìn)入S期，導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞周期停滯。

細(xì)胞衰老過(guò)程中基因表達(dá)模式存在多個(gè)動(dòng)態(tài)變化軌跡，存在保守性，且不同衰老類型中存在較大的異質(zhì)性。近年來(lái)關(guān)于該方面的研究也層出不窮，對(duì)細(xì)胞衰老過(guò)程中基因表達(dá)模式及變化規(guī)律提供了更多的新認(rèn)識(shí)。

圖10 細(xì)胞周期蛋白與激酶的介紹（圖源網(wǎng)絡(luò)）

 

 結(jié)語(yǔ)

在體內(nèi)，由于衰老細(xì)胞存在于各種組織中。不同組織的狀態(tài)、細(xì)胞衰老類型都有所區(qū)別，所以目前還沒(méi)有針對(duì)衰老細(xì)胞的絕對(duì)特異性的單一標(biāo)志物。除了我們熟知端粒學(xué)假說(shuō)，近幾年有學(xué)者基于端粒DNA和核糖體DNA(rDNA)能夠結(jié)合多種蛋白質(zhì)影響p53的發(fā)現(xiàn)，提出細(xì)胞端粒DNA和核糖體DNA(rDNA)共調(diào)控假說(shuō)。

細(xì)胞衰老的積累導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生，比如癌癥、阿爾茲海默癥等，其涉及的信號(hào)通路更是數(shù)不勝數(shù)。人類對(duì)于衰老的研究從古至今，熱情不減，相信只要人類還沒(méi)永生，衰老將會(huì)是永恒的研究熱點(diǎn)。

 

參考文獻(xiàn)：

[1] Mohamad Kamal NS, Safuan S, Shamsuddin S, Foroozandeh P. Aging of the cells: Insight into cellular senescence and detection Methods. Eur J Cell Biol. 2020 Aug;99(6):151108.