免疫組織化學技術的基本原理和實驗流程介紹
免疫組織化學技術或免疫細胞化學技術 (immunocytochemistry) 是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內抗原 (多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究。它是組織化學的分支，它是用標記的特異性抗體 (或抗原) 對組織內抗原 (或抗體) 的分布進行組織和細胞原位檢測技術。
一、免疫組化技術的基本原理
應用免疫學及組織化學原理，對組織切片或細胞標本中的某些化學成分進行原位的定性、定位或定量研究。
眾所周知，抗體與抗原之間的結合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細胞中的某些化學物質提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結合，將抗原放大，由于抗體與抗原結合后形成的免疫復合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學方法將抗原抗體反應部位顯示出來（常用顯色劑 DAB 顯示為棕黃色顆粒）。
通過抗原抗體反應及呈色反應，顯示細胞或組織中的化學成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學成分的分布、含量。組織或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質，如蛋白質、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測。
二、幾種常用免疫組織化學方法的原理
1、免疫熒光方法
是最早建立的免疫組織化學技術。它利用抗原抗體特異性結合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發光的照射后即會發出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應用比較廣。
2、免疫酶標方法
免疫酶標方法是繼免疫熒光后，于 60 年代發展起來的技術�；驹硎窍纫悦笜擞浀目贵w與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內的各種抗原成分進行定位研究。免疫酶標技術是目前最常用的技術。
本方法與免疫熒光技術相比的主要優點是：定位準確，對比度好，染色標本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。
免疫酶標方法的發展非常迅速，已經衍生出了多種標記方法，且隨著方法的不斷改進和創新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來越方便。目前在病理診斷中廣為使用的當屬 PAP 法、ABC 法、SP 法等。
3、免疫膠體金技術
免疫膠體金技術是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩定地吸附蛋白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結合免疫球蛋白的分子 (如葡萄球菌 A 蛋白) 等作為探針，就能對組織或細胞內的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。
三、免疫組織化學染色方法
1、按標記物質的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標法和免疫金銀法等。
2、按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）；與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。
3、按結合方式可分為抗原—抗體結合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法和親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法等，其中 SP 法是最常用的方法。
四、免疫組化實驗流程：
免疫組化的標本主要是組織標本和細胞標本兩大類。組織標本中包括石蠟切片（標本制作的 shou 選方法）和冰凍切片。一般而言，石蠟切片要求薄厚均勻，切片完整，且無褶無刀痕，相當考驗實驗人員的刀工，建議找專業培訓過的人員或公司進行切片。
1、脫蠟與水化：將石蠟切片放置于 60°烤箱烤片 30-60 min，這一步是為了使蠟片水分蒸發和石蠟融化，好讓組織切片牢固地貼在玻片上。而后依次將其放入二甲 benI、II、III 各 10 min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各 2 min，水洗 5 min（不要直接對著切片沖洗）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
2、細胞通透與封閉：用預熱的封閉通透液（40 ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸潤切片 30 min（RT 避光），降低內源性過氧化物酶的活性。PBS 洗 3 次，3 min/次。
3、抗原修復：由于制作石蠟切片時，甲醛固定使得蛋白之間交聯及醛基的封閉作用從而失去抗原性，這一步就是讓胞內的抗原決定簇重新「滿血復活」。
小魚常用的是微波修復，pH 6.0 的 0.01M 檸檬酸鈉緩沖液浸泡切片，在微波爐里高火 4 min 至沸騰后，取出自然冷卻至室溫，重復 2 次，每次補足液體以免干片。（當然有的朋友用酶修復法也是可以的）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
4、血清封閉：用與二抗同一來源的血清封閉一些非特異性結合位點。此時可用「zhu 傳」的油性筆圍繞組織畫圈，并對圈內的組織滴加稀釋好的血清，37℃ 溫箱中 30 min, 用濾紙吸去多余的血清。
5、孵育一抗：對圈內的組織（面積為 1×1）滴加稀釋好的一抗 20ul，4℃ 過夜或者 37℃ 1-2 h。PBS 洗 3 次，3 min/次。（一般 4℃ 過夜后，需要將切片放置 37℃ 復溫 45 min，防止脫片以及可使抗原抗體結合的更穩定）
6、孵育二抗：對圈內的組織（面積為 1×1）滴加稀釋好的二抗 20ul，37℃ 1-2 h，PBS 洗 3 次，3 min/次。
7、切片顯色：用 DAB-H2O2 顯色 10 min，顯色液最好是現用現配，此時要通過顯微鏡觀察染色是否明顯，10 min 內即可用蒸餾水終止顯色。
8、復染及封片：為了形成細胞輪廓，更好的定位目標蛋白，可用 Mayer 蘇木素染色 30s，水洗，鹽酸酒精分化 2s，流水浸入 15 min。脫水時，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）各 2 min。二甲 ben 5 min 使切片透明化，最后加入中性樹膠封片（一般封片后最好立即拍照，若不能及時拍照，可用指甲油封固并保持好避光和濕度）。
五、免疫組化技術的優點
1、特異性強
免疫學的基本原理決定了抗原與抗體之間的結合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA 顯示淋巴細胞成分。只有當組織細胞中存在交叉抗原時才會出現交叉反應。
2、敏感性高
在應用免疫組化的起始階段，由于技術上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術，那時的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現在由于 ABC 法或 SP 法的出現，使抗體稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細胞中與抗原結合，這樣高敏感性的抗體抗原反應，使免疫組化方法越來越方便地應用于常規病理診斷工作。
3、定位準確、形態與功能相結合
該技術通過抗原抗體反應及呈色反應，可在組織和細胞中進行抗原的準確定位，因而可同時對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察，這樣就可以進行形態與功能相結合的研究，對病理學研究的深入是十分有意義的。
一、免疫組化技術的基本原理
應用免疫學及組織化學原理，對組織切片或細胞標本中的某些化學成分進行原位的定性、定位或定量研究。
眾所周知，抗體與抗原之間的結合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細胞中的某些化學物質提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結合，將抗原放大，由于抗體與抗原結合后形成的免疫復合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學方法將抗原抗體反應部位顯示出來（常用顯色劑 DAB 顯示為棕黃色顆粒）。
通過抗原抗體反應及呈色反應，顯示細胞或組織中的化學成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學成分的分布、含量。組織或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質，如蛋白質、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測。
二、幾種常用免疫組織化學方法的原理
1、免疫熒光方法
是最早建立的免疫組織化學技術。它利用抗原抗體特異性結合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發光的照射后即會發出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應用比較廣。
2、免疫酶標方法
免疫酶標方法是繼免疫熒光后，于 60 年代發展起來的技術�；驹硎窍纫悦笜擞浀目贵w與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內的各種抗原成分進行定位研究。免疫酶標技術是目前最常用的技術。
本方法與免疫熒光技術相比的主要優點是：定位準確，對比度好，染色標本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。
免疫酶標方法的發展非常迅速，已經衍生出了多種標記方法，且隨著方法的不斷改進和創新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來越方便。目前在病理診斷中廣為使用的當屬 PAP 法、ABC 法、SP 法等。
3、免疫膠體金技術
免疫膠體金技術是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩定地吸附蛋白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結合免疫球蛋白的分子 (如葡萄球菌 A 蛋白) 等作為探針，就能對組織或細胞內的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。
三、免疫組織化學染色方法
1、按標記物質的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標法和免疫金銀法等。
2、按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）；與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。
3、按結合方式可分為抗原—抗體結合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法和親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法等，其中 SP 法是最常用的方法。
四、免疫組化實驗流程：
免疫組化的標本主要是組織標本和細胞標本兩大類。組織標本中包括石蠟切片（標本制作的 shou 選方法）和冰凍切片。一般而言，石蠟切片要求薄厚均勻，切片完整，且無褶無刀痕，相當考驗實驗人員的刀工，建議找專業培訓過的人員或公司進行切片。
1、脫蠟與水化：將石蠟切片放置于 60°烤箱烤片 30-60 min，這一步是為了使蠟片水分蒸發和石蠟融化，好讓組織切片牢固地貼在玻片上。而后依次將其放入二甲 benI、II、III 各 10 min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各 2 min，水洗 5 min（不要直接對著切片沖洗）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
2、細胞通透與封閉：用預熱的封閉通透液（40 ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸潤切片 30 min（RT 避光），降低內源性過氧化物酶的活性。PBS 洗 3 次，3 min/次。
3、抗原修復：由于制作石蠟切片時，甲醛固定使得蛋白之間交聯及醛基的封閉作用從而失去抗原性，這一步就是讓胞內的抗原決定簇重新「滿血復活」。
小魚常用的是微波修復，pH 6.0 的 0.01M 檸檬酸鈉緩沖液浸泡切片，在微波爐里高火 4 min 至沸騰后，取出自然冷卻至室溫，重復 2 次，每次補足液體以免干片。（當然有的朋友用酶修復法也是可以的）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
4、血清封閉：用與二抗同一來源的血清封閉一些非特異性結合位點。此時可用「zhu 傳」的油性筆圍繞組織畫圈，并對圈內的組織滴加稀釋好的血清，37℃ 溫箱中 30 min, 用濾紙吸去多余的血清。
5、孵育一抗：對圈內的組織（面積為 1×1）滴加稀釋好的一抗 20ul，4℃ 過夜或者 37℃ 1-2 h。PBS 洗 3 次，3 min/次。（一般 4℃ 過夜后，需要將切片放置 37℃ 復溫 45 min，防止脫片以及可使抗原抗體結合的更穩定）
6、孵育二抗：對圈內的組織（面積為 1×1）滴加稀釋好的二抗 20ul，37℃ 1-2 h，PBS 洗 3 次，3 min/次。
7、切片顯色：用 DAB-H2O2 顯色 10 min，顯色液最好是現用現配，此時要通過顯微鏡觀察染色是否明顯，10 min 內即可用蒸餾水終止顯色。
8、復染及封片：為了形成細胞輪廓，更好的定位目標蛋白，可用 Mayer 蘇木素染色 30s，水洗，鹽酸酒精分化 2s，流水浸入 15 min。脫水時，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）各 2 min。二甲 ben 5 min 使切片透明化，最后加入中性樹膠封片（一般封片后最好立即拍照，若不能及時拍照，可用指甲油封固并保持好避光和濕度）。
五、免疫組化技術的優點
1、特異性強
免疫學的基本原理決定了抗原與抗體之間的結合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA 顯示淋巴細胞成分。只有當組織細胞中存在交叉抗原時才會出現交叉反應。
2、敏感性高
在應用免疫組化的起始階段，由于技術上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術，那時的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現在由于 ABC 法或 SP 法的出現，使抗體稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細胞中與抗原結合，這樣高敏感性的抗體抗原反應，使免疫組化方法越來越方便地應用于常規病理診斷工作。
3、定位準確、形態與功能相結合
該技術通過抗原抗體反應及呈色反應，可在組織和細胞中進行抗原的準確定位，因而可同時對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察，這樣就可以進行形態與功能相結合的研究，對病理學研究的深入是十分有意義的。
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