ELISA雙抗體夾心法的原理和步驟介紹
酶聯(lián)接免疫吸附測(cè)定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ），簡(jiǎn)稱ELISA，是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
1.原理：
免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識(shí)別和結(jié)合原理，對(duì)待測(cè)抗體或者抗原進(jìn)行分析測(cè)定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個(gè)部分組成：免疫識(shí)別，信號(hào)輸出和數(shù)據(jù)處理。
2.步驟：
免疫識(shí)別是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗體，而后利用抗體識(shí)別待測(cè)的抗原（通常是疾病的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，病毒，細(xì)菌等等，從復(fù)雜待測(cè)液中將抗原吸附到96孔板表面。接著用帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、熒光或放射性標(biāo)記的抗體通過直接或者間接的方式輸出識(shí)別信號(hào)。最后利用信號(hào)強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度梯度等信息計(jì)算得出待測(cè)樣中目標(biāo)抗原的濃度。
3.分類：
根據(jù)免疫識(shí)別和信號(hào)輸出方式的不同，ELISA可以分為雙抗體夾心法、直接免疫競(jìng)爭(zhēng)法和非直接免疫競(jìng)爭(zhēng)法等等。其中雙抗體夾心法在應(yīng)用上最常見。
雙抗體夾心法類型分為直接夾心和間接夾心。檢測(cè)抗體是酶標(biāo)抗體，則可稱為直接夾心ELISA；檢測(cè)抗體不帶有標(biāo)記，則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測(cè)抗體結(jié)合，這種稱為間接夾心ELISA。
直接夾心又分為雙抗體夾心和雙抗原夾心。夾心ELISA實(shí)驗(yàn)需要用到配對(duì)抗體（捕獲抗體和檢測(cè)抗體），
3.1、原理：
將捕獲抗體結(jié)合到ELISA板上，通過捕獲抗體固定抗原，隨后通過直接或間接ELISA的方式進(jìn)行檢測(cè)。在夾心ELISA實(shí)驗(yàn)中，最重要的是對(duì)配對(duì)抗體進(jìn)行驗(yàn)證，確保配對(duì)抗體能同時(shí)與抗原結(jié)合，以確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
3.2、特點(diǎn)：
常用于抗原測(cè)定，適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原。優(yōu)點(diǎn)：高靈敏、高專一性，抗原無須事先純化。缺點(diǎn)：抗原一定得擁有兩個(gè)以上的抗體結(jié)合部位。
3.3：雙抗體夾心法步驟：
①：抗體包被 在96孔板上包被抗體。由于酶標(biāo)板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯環(huán)與抗體的氨基酸殘基具有類似π-π堆積作用的引力，結(jié)合靜電和疏水作用，可以將抗體吸附于其表面。然后，將未吸附的抗體用緩沖液清洗后，加入含有明膠或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封閉液以封閉酶標(biāo)板上未結(jié)合抗體的部分。加入封閉液的目的，是防止其他蛋白因靜電或疏水作用吸附在96孔板上，造成假陽性信號(hào)，干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。
②：免疫識(shí)別 在96孔板上包被抗體后，加入待測(cè)樣，并在37°C環(huán)境下孵育一段時(shí)間，通常是1-2小時(shí)。此時(shí)酶標(biāo)板上的抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行特異性識(shí)別結(jié)合。此處抗體的質(zhì)量是關(guān)鍵，好的抗體既能特異性高效地結(jié)合抗原又不受待測(cè)樣中其他生物大分子、蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽等成分的影響。
③：洗板 將未結(jié)合的抗原洗掉，加入該抗原所對(duì)應(yīng)的識(shí)別抗體并在37°C下繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時(shí)，接著將未連接上抗原的抗體洗掉。
④：酶標(biāo)信號(hào)輸出 加入帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，用于和標(biāo)準(zhǔn)抗體結(jié)合。在培養(yǎng)30分鐘后洗掉未連接的二抗，并加入顯色劑顯色。根據(jù)顯色的結(jié)果判斷抗原的濃度。一般認(rèn)為，抗原濃度與顯色后的發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān)。
免疫競(jìng)爭(zhēng)法：
以抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體為例，在上述免疫夾心法操作步驟的第二步加入待測(cè)抗原后，立刻加入酶標(biāo)抗原，使之與待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)識(shí)別酶標(biāo)板上的抗體。當(dāng)待測(cè)抗原濃度越高，能夠連上酶標(biāo)板上抗體的酶標(biāo)抗體就越少，輸出的信號(hào)就越少。這樣待測(cè)樣濃度與酶顯色信號(hào)就呈逆相關(guān)。
1.原理：
免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識(shí)別和結(jié)合原理，對(duì)待測(cè)抗體或者抗原進(jìn)行分析測(cè)定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個(gè)部分組成：免疫識(shí)別，信號(hào)輸出和數(shù)據(jù)處理。
2.步驟：
免疫識(shí)別是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗體，而后利用抗體識(shí)別待測(cè)的抗原（通常是疾病的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，病毒，細(xì)菌等等，從復(fù)雜待測(cè)液中將抗原吸附到96孔板表面。接著用帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、熒光或放射性標(biāo)記的抗體通過直接或者間接的方式輸出識(shí)別信號(hào)。最后利用信號(hào)強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度梯度等信息計(jì)算得出待測(cè)樣中目標(biāo)抗原的濃度。
3.分類：
根據(jù)免疫識(shí)別和信號(hào)輸出方式的不同，ELISA可以分為雙抗體夾心法、直接免疫競(jìng)爭(zhēng)法和非直接免疫競(jìng)爭(zhēng)法等等。其中雙抗體夾心法在應(yīng)用上最常見。
雙抗體夾心法類型分為直接夾心和間接夾心。檢測(cè)抗體是酶標(biāo)抗體，則可稱為直接夾心ELISA；檢測(cè)抗體不帶有標(biāo)記，則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測(cè)抗體結(jié)合，這種稱為間接夾心ELISA。
直接夾心又分為雙抗體夾心和雙抗原夾心。夾心ELISA實(shí)驗(yàn)需要用到配對(duì)抗體（捕獲抗體和檢測(cè)抗體），
3.1、原理：
將捕獲抗體結(jié)合到ELISA板上，通過捕獲抗體固定抗原，隨后通過直接或間接ELISA的方式進(jìn)行檢測(cè)。在夾心ELISA實(shí)驗(yàn)中，最重要的是對(duì)配對(duì)抗體進(jìn)行驗(yàn)證，確保配對(duì)抗體能同時(shí)與抗原結(jié)合，以確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
3.2、特點(diǎn)：
常用于抗原測(cè)定，適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原。優(yōu)點(diǎn)：高靈敏、高專一性，抗原無須事先純化。缺點(diǎn)：抗原一定得擁有兩個(gè)以上的抗體結(jié)合部位。
3.3：雙抗體夾心法步驟：
①：抗體包被 在96孔板上包被抗體。由于酶標(biāo)板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯環(huán)與抗體的氨基酸殘基具有類似π-π堆積作用的引力，結(jié)合靜電和疏水作用，可以將抗體吸附于其表面。然后，將未吸附的抗體用緩沖液清洗后，加入含有明膠或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封閉液以封閉酶標(biāo)板上未結(jié)合抗體的部分。加入封閉液的目的，是防止其他蛋白因靜電或疏水作用吸附在96孔板上，造成假陽性信號(hào)，干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。
②：免疫識(shí)別 在96孔板上包被抗體后，加入待測(cè)樣，并在37°C環(huán)境下孵育一段時(shí)間，通常是1-2小時(shí)。此時(shí)酶標(biāo)板上的抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行特異性識(shí)別結(jié)合。此處抗體的質(zhì)量是關(guān)鍵，好的抗體既能特異性高效地結(jié)合抗原又不受待測(cè)樣中其他生物大分子、蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽等成分的影響。
③：洗板 將未結(jié)合的抗原洗掉，加入該抗原所對(duì)應(yīng)的識(shí)別抗體并在37°C下繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時(shí)，接著將未連接上抗原的抗體洗掉。
④：酶標(biāo)信號(hào)輸出 加入帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，用于和標(biāo)準(zhǔn)抗體結(jié)合。在培養(yǎng)30分鐘后洗掉未連接的二抗，并加入顯色劑顯色。根據(jù)顯色的結(jié)果判斷抗原的濃度。一般認(rèn)為，抗原濃度與顯色后的發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān)。
免疫競(jìng)爭(zhēng)法：
以抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體為例，在上述免疫夾心法操作步驟的第二步加入待測(cè)抗原后，立刻加入酶標(biāo)抗原，使之與待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)識(shí)別酶標(biāo)板上的抗體。當(dāng)待測(cè)抗原濃度越高，能夠連上酶標(biāo)板上抗體的酶標(biāo)抗體就越少，輸出的信號(hào)就越少。這樣待測(cè)樣濃度與酶顯色信號(hào)就呈逆相關(guān)。
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