熒光二抗甄選擇的方法介紹
在生物醫(yī)學研究中，熒光標記技術因其高靈敏度和特異性而被廣泛應用于各種實驗中，如細胞成像、蛋白質定位、流式細胞術等。熒光二抗（熒光標記的二抗）是其中一種關鍵的試劑，其選擇方法對實驗結果的準確性和可靠性至關重要。
1、如何選擇熒光基團?
在選擇用于科學研究的熒光基團時，主要考慮熒光基團組合的設計。在用于多重檢測實驗時，選擇彼此兼容的熒光基團組合以及檢測和分析它們的儀器是至關重要的。
（1）建議使用明亮的熒光基團(如PE, Alexa Fluor®488)檢測弱表達的靶標，而不太明亮的熒光基團(如FITC)可用于檢測大量表達的靶標；
（2）考慮每個熒光基團的激發(fā)和發(fā)射光譜，最大限度地減少光譜重疊和避免背景干擾也很重要；根據儀器具有的激光激發(fā)波長和檢測通道選擇合適的熒光基團；
（3）另外選擇光譜不與內源熒光重疊的熒光基團，檢查未染色的標本以確定樣品是否顯示自身熒光。
（4）另一個策略是確認多個熒光二抗組合時產生的熒光信號與單個熒光抗體相同；這將排除由于不同抗體混合在一起而產生的交叉反應或阻斷效應。可以用單個熒光抗體作為對照。
（5）另外，所有的熒光基團都應該妥善儲存，遠離光線。到保質期的試劑應該與新試劑一起測試，以確保亮度不受影響。一些熒光基團可能對常見的固定和滲透緩沖液敏感，在實驗時應進行優(yōu)化。某些熒光基團可能與某些細胞類型或結構非特異性結合，雖然封閉液可以防止這種情況，在和其他熒光基團一起使用時需要檢查。
2、抗體特異性
理想的熒光二抗應具有高度特異性，能夠特異性識別目標抗原，避免非特異性結合。這不僅有助于提高實驗結果的準確性，還能減少背景噪聲。在選擇熒光二抗時，應仔細查閱產品說明書，了解其特異性和交叉反應情況。Jackson提供超2000種的預吸附二抗，可以最大程度地消除了特點物種之間交叉反應，適合用于多標記的IF/IHC/ICC實驗，并可獲得更低的背景值。
3、抗體濃度
熒光二抗的濃度直接影響熒光信號的強度和背景噪聲。過高的抗體濃度可能增加非特異性結合，導致背景噪聲增加；而過低的抗體濃度則可能使信號強度不足。實驗中應通過預實驗確定最佳抗體濃度，以獲得最佳的熒光信號。
4、抗體形式
在研究某些細胞和組織時（如白細胞群體：巨噬細胞、B細胞、自然殺傷細胞等；某些組織：淋巴結，脾臟，外周血等），這些細胞或組織因表面Fc端受體過多，會與抗體分子中的Fc端相結合，從而導致非特異性結合和高背景的現(xiàn)象（如下圖所示），俗稱“假陽性”。
使用F(ab')₂ 形式的二抗可以避免其與活細胞中的Fc受體非特異性結合，從而提高實驗準確性。
5、反應種屬
熒光二抗的反應種屬應和一抗的宿主來源一致，如果是多標熒光實驗，多個二抗的宿主來源最好一致，并且建議選擇預吸附二抗以減少交叉反應。
Jackson ImmunoResearch Inc.（JIR）是世界著名二抗生產商，致力于生產親和純化的二抗金標準品牌。
Jackson熒光二抗的優(yōu)勢：
1. 高靈敏度，線性范圍廣；
2. 高稀釋比，性價比高；
3. 高特異性：10種特異性，包括IgG(H+L)、IgG Light Chain、IgG F(ab’)2、IgG VHH、IgG Fc、IgG + IgM、IgA + IgG + IgM、IgM、IgA和IgE；
4. 種屬豐富：16種種屬，包括小鼠、大鼠、人、兔、綿羊、羊駝、牛、貓、雞、狗、山羊、綿羊、豚鼠、馬、倉鼠、豬；
5. 標記豐富：從藍光到近紅外光譜范圍（400 nm~1400 nm）內，涵蓋了19種不同的熒光標記染料，分辨率高并且儀器兼容性廣；
6. 穩(wěn)定性好：親和純化二抗，光耐受性（抗淬滅性）強，水溶性好，儲存不會產生沉淀，pH值不敏感；
7. 可消除物種之間的交叉反應：Jackson提供超2000種的預吸附二抗，可以最大程度地消除了特點物種之間交叉反應，適合用于多標記的IF/IHC/ICC實驗，并可獲得更低的背景值。（產品名稱min X后的物種已驗證過不會交叉反應）。
1、如何選擇熒光基團?
在選擇用于科學研究的熒光基團時，主要考慮熒光基團組合的設計。在用于多重檢測實驗時，選擇彼此兼容的熒光基團組合以及檢測和分析它們的儀器是至關重要的。
（1）建議使用明亮的熒光基團(如PE, Alexa Fluor®488)檢測弱表達的靶標，而不太明亮的熒光基團(如FITC)可用于檢測大量表達的靶標；
（2）考慮每個熒光基團的激發(fā)和發(fā)射光譜，最大限度地減少光譜重疊和避免背景干擾也很重要；根據儀器具有的激光激發(fā)波長和檢測通道選擇合適的熒光基團；
（3）另外選擇光譜不與內源熒光重疊的熒光基團，檢查未染色的標本以確定樣品是否顯示自身熒光。
（4）另一個策略是確認多個熒光二抗組合時產生的熒光信號與單個熒光抗體相同；這將排除由于不同抗體混合在一起而產生的交叉反應或阻斷效應。可以用單個熒光抗體作為對照。
（5）另外，所有的熒光基團都應該妥善儲存，遠離光線。到保質期的試劑應該與新試劑一起測試，以確保亮度不受影響。一些熒光基團可能對常見的固定和滲透緩沖液敏感，在實驗時應進行優(yōu)化。某些熒光基團可能與某些細胞類型或結構非特異性結合，雖然封閉液可以防止這種情況，在和其他熒光基團一起使用時需要檢查。
2、抗體特異性
理想的熒光二抗應具有高度特異性，能夠特異性識別目標抗原，避免非特異性結合。這不僅有助于提高實驗結果的準確性，還能減少背景噪聲。在選擇熒光二抗時，應仔細查閱產品說明書，了解其特異性和交叉反應情況。Jackson提供超2000種的預吸附二抗，可以最大程度地消除了特點物種之間交叉反應，適合用于多標記的IF/IHC/ICC實驗，并可獲得更低的背景值。
3、抗體濃度
熒光二抗的濃度直接影響熒光信號的強度和背景噪聲。過高的抗體濃度可能增加非特異性結合，導致背景噪聲增加；而過低的抗體濃度則可能使信號強度不足。實驗中應通過預實驗確定最佳抗體濃度，以獲得最佳的熒光信號。
4、抗體形式
在研究某些細胞和組織時（如白細胞群體：巨噬細胞、B細胞、自然殺傷細胞等；某些組織：淋巴結，脾臟，外周血等），這些細胞或組織因表面Fc端受體過多，會與抗體分子中的Fc端相結合，從而導致非特異性結合和高背景的現(xiàn)象（如下圖所示），俗稱“假陽性”。
使用F(ab')₂ 形式的二抗可以避免其與活細胞中的Fc受體非特異性結合，從而提高實驗準確性。
5、反應種屬
熒光二抗的反應種屬應和一抗的宿主來源一致，如果是多標熒光實驗，多個二抗的宿主來源最好一致，并且建議選擇預吸附二抗以減少交叉反應。
Jackson ImmunoResearch Inc.（JIR）是世界著名二抗生產商，致力于生產親和純化的二抗金標準品牌。
Jackson熒光二抗的優(yōu)勢：
1. 高靈敏度，線性范圍廣；
2. 高稀釋比，性價比高；
3. 高特異性：10種特異性，包括IgG(H+L)、IgG Light Chain、IgG F(ab’)2、IgG VHH、IgG Fc、IgG + IgM、IgA + IgG + IgM、IgM、IgA和IgE；
4. 種屬豐富：16種種屬，包括小鼠、大鼠、人、兔、綿羊、羊駝、牛、貓、雞、狗、山羊、綿羊、豚鼠、馬、倉鼠、豬；
5. 標記豐富：從藍光到近紅外光譜范圍（400 nm~1400 nm）內，涵蓋了19種不同的熒光標記染料，分辨率高并且儀器兼容性廣；
6. 穩(wěn)定性好：親和純化二抗，光耐受性（抗淬滅性）強，水溶性好，儲存不會產生沉淀，pH值不敏感；
7. 可消除物種之間的交叉反應：Jackson提供超2000種的預吸附二抗，可以最大程度地消除了特點物種之間交叉反應，適合用于多標記的IF/IHC/ICC實驗，并可獲得更低的背景值。（產品名稱min X后的物種已驗證過不會交叉反應）。
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