ELISA實驗的樣本收集及稀釋處理詳述
用于ELISA實驗的樣本有多種類型，包括血清和血漿、細胞培養上清、尿液以及組織勻漿等。不同樣本類型的預處理方法存在差異。合適的樣本預處理，是確保ELISA實驗準確性的第一步。下面介紹幾種不同樣本類型的處理方法：
常規樣本處理方式：
血液樣本
血液樣本分為全血、血漿、血清三種。簡單描述：
全血：全血=血漿+血細胞。
血漿：全血加抗凝劑后離心分離出來的淡黃色液體是血漿。
血清：全血不加抗凝劑而自然凝固后分離出來的，不含纖維蛋白原的淡黃色液體是血清。
血液樣本是ELISA/液相實驗最常用的樣本。在收集血液樣本的過程中應避免溶血，因為紅細胞在溶解時會釋放具有過氧化物酶活性的物質，將會出現非特異性顯色反應，導致檢測結果不準確，出現假陽性結果。另外，樣本還需要避免細菌污染，因為其可能會導致樣本含有內源性HRP，也會導致檢測結果不準確。且要避免使用高血脂樣本。脂質會影響抗原抗體的結合，從而影響測值的準確性。
1.血清和血漿
血清是ELISA實驗最常用的樣本，其預處理也十分簡單。
① 使用無熱原、無內毒素的試管或離心管采集血液樣本，將試管或離心管在室溫下放置1小時或2-8℃過夜，分離出血清；
② 2-8℃條件下，以1000×g離心20分鐘，小心收集上層血清。
血漿樣本
① 使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后30分鐘內，2-8℃條件下，以1000×g離心15分鐘，小心收集上層血漿；
② 常見的抗凝劑包括：EDTA鈉鹽，肝素鈉，枸櫞酸鈉等。
2.細胞培養上清
將細胞培養上清液吸入離心管中，在2-8℃條件下，以1000×g離心20分鐘，除去細胞碎片和雜質，收集上清液。
3.細胞裂解液
① 吸出培養板中的培養基，用胰蛋白酶消化細胞，再加入適量的培養基，將培養板上的細胞沖洗干凈（懸浮細胞可以省略該步驟）；
② 將細胞懸浮液收集到離心管中，在2-8℃條件下，以1000×g離心5分鐘，再吸去培養基，用預冷PBS洗滌細胞3次；
③ 加入適量的預冷PBS（建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑），重懸細胞。添加比例：約1×106個細胞加入150-250μL PBS重懸細胞；
④ 使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復凍融，重復凍融過程數次，直至細胞完全裂解。也可使用超聲波細胞破碎器，超聲處理懸浮液來裂解細胞；
⑤ 2-8℃條件下，以1500×g離心10分鐘，去除細胞碎片，收集上清液。
4.組織勻漿
① 用預冷的PBS（0.01M，PH7.4）沖洗組織，除去表面殘留的血液或雜質；
② 將組織塊稱重，再切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿；
③ 加入適量的預冷PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g組織樣品對應9mL PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑），用玻璃勻漿器在冰上或冰浴中充分勻漿。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融；
④ 將勻漿液吸入離心管中，2-8℃條件下，以5000×g離心5分鐘，收集上清液。
5.腦脊液
根據實驗要求，取適量上清液進行實驗測定。
大鼠腦脊液采集方法：采集腦脊液時，用濕紗布擦試大鼠頸背部皮膚，剪去背毛暴露皮膚。兩耳連線剪一橫切口(1.5cm 左右)，在其中點向尾側沿皮下剪開 2cm，將皮分離兩側，擴大視野。緊貼大鼠頭 骨依次逐層剪切各肌層，并斷端依次拉向尾側擴大視野。注意，有出血時用干紗 布按壓止血，保持術口清晰。接近頸后黃韌帶時，小心地用 7 號注射針頭分離覆 蓋的肌肉，暴露寰枕膜。用 1ml 注射器(針頭用止血鉗使針尖與針體成 150 度鈍 角)，針斜面向上，針尖端近水平刺入蛛網膜下腔，固定針體，緩慢抽取腦脊液， 一般采集量為 100-200 微升。
6.肺泡灌洗液
① 10%水合氯醛溶液，麻醉腹腔。打開腹腔，另取10mL注射器進行下腔靜脈采血，盡可能將血放盡。
② 在冰面上對肺進行肺灌洗。取37℃生理鹽水5mL，分三次灌洗：2mL、1.5mL、1.5mL灌洗，回收率在70%以上。
③ 使用無菌管收集肺泡灌洗液后1000xg離心10min，離心后收集上清，并將標本保存于-20℃或-80℃，且應避免反復凍融，如有沉淀形成，應再次離心。
樣本保存方法：
樣品收集后，若在1周內進行檢測，可保存于2-8℃的環境中；若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測）或-80℃（3個月內檢測）的環境中，避免反復凍融。實驗前，建議再次離心，去除沉淀物。
注意事項：
1、試劑盒的檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍。如果樣品中檢測物濃度高于標準品的最高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋（建議查閱文獻，并做預實驗）。
2、收集組織與細胞提取液樣本時，不建議使用商品化的裂解試劑。裂解試劑中的成分，可能會影響抗原抗體結合，或造成基質干擾，最終影響實驗結果。
一個準確的ELISA檢測實驗，必須包含三大要素：性能可靠的試劑盒、造模成功并準確采集的樣本、可控環境且嚴謹實驗操作，三者缺一不可。在操作過程中，經常遇到樣本稀釋問題，需要進行樣本稀釋。
一、在ELISA實驗過程中，超過試劑盒檢測范圍的，一般有這幾種情況。
樣本值高的可能情況:
1、樣本中待測物含量過高。一些高豐度蛋白來說，比如免疫球蛋白、脂聯素、C肽、載脂蛋白等，在樣本中本身含量就很高，有的達到mg/mL濃度。
2、一些受誘導表達的細胞上清中，大量表達，比如小鼠細胞誘導后，大量表達腫瘤壞死因子α（TNFα），小鼠胰島細胞受誘導后，大量表達胰島素（INS）。
3、在一些感染性疾病中，大量表達，比如乙肝表面抗原、C反應蛋白。
4、疫苗原性研究時，注射疫苗的小鼠，會產生大量針對疫苗的抗體。
5、一些被濃縮的樣品，比如重組蛋白的產物，單克隆抗體純品等。
二.如何確定測定樣本的稀釋倍數呢？樣本稀釋的原則如下：
在查詢背景知識，或者通過預實驗，確認了樣本濃度過高，需要進行稀釋，就要根據以下原則，嚴謹操作和計算。
1、稀釋倍數合理。稀釋后樣本測定的OD值，要求落在標準品最高值OD值的半量程內，假定標準品最高值的OD值是2.4，那么稀釋后的樣本，OD值接近1.2，在這個范圍附近，計算的濃度值最為準確，以這個結果乘以稀釋倍數，得到的樣本濃度最準確。
2、稀釋過程規范。特別是大倍比的稀釋，最好是梯度稀釋。比如樣本要稀釋200倍，就先稀釋10倍，再在10倍稀釋的基礎上，再進行稀釋20倍，得到200倍。
3、樣本取樣量不要太小。在樣本充足的情況下，樣本取樣量不要低于5uL，越低的取樣量，在混勻取樣過程中，誤差越大。
三、在ELISA檢測過程中，經常會遇到這樣的問題：
樣本測定OD值超過標曲最高點OD值，造成測定數據無法直接使用。樣本必須進行稀釋，如何確定測定樣本的稀釋倍數？咱們先了解下 樣本稀釋容易犯的錯誤有哪些？
1、稀釋不足。稀釋倍數不足時，容易導致最終結果偏小。
2、過度稀釋。過度稀釋時，容易導致最終結果偏大。
3、稀釋不夠規范，引入很多人為偏差。稀釋不夠規范，特別是大比例稀釋時，人為偏差大大增加。
常規樣本處理方式：
血液樣本
血液樣本分為全血、血漿、血清三種。簡單描述：
全血：全血=血漿+血細胞。
血漿：全血加抗凝劑后離心分離出來的淡黃色液體是血漿。
血清：全血不加抗凝劑而自然凝固后分離出來的，不含纖維蛋白原的淡黃色液體是血清。
血液樣本是ELISA/液相實驗最常用的樣本。在收集血液樣本的過程中應避免溶血，因為紅細胞在溶解時會釋放具有過氧化物酶活性的物質，將會出現非特異性顯色反應，導致檢測結果不準確，出現假陽性結果。另外，樣本還需要避免細菌污染，因為其可能會導致樣本含有內源性HRP，也會導致檢測結果不準確。且要避免使用高血脂樣本。脂質會影響抗原抗體的結合，從而影響測值的準確性。
1.血清和血漿
血清是ELISA實驗最常用的樣本，其預處理也十分簡單。
① 使用無熱原、無內毒素的試管或離心管采集血液樣本，將試管或離心管在室溫下放置1小時或2-8℃過夜，分離出血清；
② 2-8℃條件下，以1000×g離心20分鐘，小心收集上層血清。
血漿樣本
① 使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后30分鐘內，2-8℃條件下，以1000×g離心15分鐘，小心收集上層血漿；
② 常見的抗凝劑包括：EDTA鈉鹽，肝素鈉，枸櫞酸鈉等。
2.細胞培養上清
將細胞培養上清液吸入離心管中，在2-8℃條件下，以1000×g離心20分鐘，除去細胞碎片和雜質，收集上清液。
3.細胞裂解液
① 吸出培養板中的培養基，用胰蛋白酶消化細胞，再加入適量的培養基，將培養板上的細胞沖洗干凈（懸浮細胞可以省略該步驟）；
② 將細胞懸浮液收集到離心管中，在2-8℃條件下，以1000×g離心5分鐘，再吸去培養基，用預冷PBS洗滌細胞3次；
③ 加入適量的預冷PBS（建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑），重懸細胞。添加比例：約1×106個細胞加入150-250μL PBS重懸細胞；
④ 使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復凍融，重復凍融過程數次，直至細胞完全裂解。也可使用超聲波細胞破碎器，超聲處理懸浮液來裂解細胞；
⑤ 2-8℃條件下，以1500×g離心10分鐘，去除細胞碎片，收集上清液。
4.組織勻漿
① 用預冷的PBS（0.01M，PH7.4）沖洗組織，除去表面殘留的血液或雜質；
② 將組織塊稱重，再切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿；
③ 加入適量的預冷PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g組織樣品對應9mL PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑），用玻璃勻漿器在冰上或冰浴中充分勻漿。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融；
④ 將勻漿液吸入離心管中，2-8℃條件下，以5000×g離心5分鐘，收集上清液。
5.腦脊液
根據實驗要求，取適量上清液進行實驗測定。
大鼠腦脊液采集方法：采集腦脊液時，用濕紗布擦試大鼠頸背部皮膚，剪去背毛暴露皮膚。兩耳連線剪一橫切口(1.5cm 左右)，在其中點向尾側沿皮下剪開 2cm，將皮分離兩側，擴大視野。緊貼大鼠頭 骨依次逐層剪切各肌層，并斷端依次拉向尾側擴大視野。注意，有出血時用干紗 布按壓止血，保持術口清晰。接近頸后黃韌帶時，小心地用 7 號注射針頭分離覆 蓋的肌肉，暴露寰枕膜。用 1ml 注射器(針頭用止血鉗使針尖與針體成 150 度鈍 角)，針斜面向上，針尖端近水平刺入蛛網膜下腔，固定針體，緩慢抽取腦脊液， 一般采集量為 100-200 微升。
6.肺泡灌洗液
① 10%水合氯醛溶液，麻醉腹腔。打開腹腔，另取10mL注射器進行下腔靜脈采血，盡可能將血放盡。
② 在冰面上對肺進行肺灌洗。取37℃生理鹽水5mL，分三次灌洗：2mL、1.5mL、1.5mL灌洗，回收率在70%以上。
③ 使用無菌管收集肺泡灌洗液后1000xg離心10min，離心后收集上清，并將標本保存于-20℃或-80℃，且應避免反復凍融，如有沉淀形成，應再次離心。
樣本保存方法：
樣品收集后，若在1周內進行檢測，可保存于2-8℃的環境中；若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測）或-80℃（3個月內檢測）的環境中，避免反復凍融。實驗前，建議再次離心，去除沉淀物。
注意事項：
1、試劑盒的檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍。如果樣品中檢測物濃度高于標準品的最高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋（建議查閱文獻，并做預實驗）。
2、收集組織與細胞提取液樣本時，不建議使用商品化的裂解試劑。裂解試劑中的成分，可能會影響抗原抗體結合，或造成基質干擾，最終影響實驗結果。
一個準確的ELISA檢測實驗，必須包含三大要素：性能可靠的試劑盒、造模成功并準確采集的樣本、可控環境且嚴謹實驗操作，三者缺一不可。在操作過程中，經常遇到樣本稀釋問題，需要進行樣本稀釋。
一、在ELISA實驗過程中，超過試劑盒檢測范圍的，一般有這幾種情況。
樣本值高的可能情況:
1、樣本中待測物含量過高。一些高豐度蛋白來說，比如免疫球蛋白、脂聯素、C肽、載脂蛋白等，在樣本中本身含量就很高，有的達到mg/mL濃度。
2、一些受誘導表達的細胞上清中，大量表達，比如小鼠細胞誘導后，大量表達腫瘤壞死因子α（TNFα），小鼠胰島細胞受誘導后，大量表達胰島素（INS）。
3、在一些感染性疾病中，大量表達，比如乙肝表面抗原、C反應蛋白。
4、疫苗原性研究時，注射疫苗的小鼠，會產生大量針對疫苗的抗體。
5、一些被濃縮的樣品，比如重組蛋白的產物，單克隆抗體純品等。
二.如何確定測定樣本的稀釋倍數呢？樣本稀釋的原則如下：
在查詢背景知識，或者通過預實驗，確認了樣本濃度過高，需要進行稀釋，就要根據以下原則，嚴謹操作和計算。
1、稀釋倍數合理。稀釋后樣本測定的OD值，要求落在標準品最高值OD值的半量程內，假定標準品最高值的OD值是2.4，那么稀釋后的樣本，OD值接近1.2，在這個范圍附近，計算的濃度值最為準確，以這個結果乘以稀釋倍數，得到的樣本濃度最準確。
2、稀釋過程規范。特別是大倍比的稀釋，最好是梯度稀釋。比如樣本要稀釋200倍，就先稀釋10倍，再在10倍稀釋的基礎上，再進行稀釋20倍，得到200倍。
3、樣本取樣量不要太小。在樣本充足的情況下，樣本取樣量不要低于5uL，越低的取樣量，在混勻取樣過程中，誤差越大。
三、在ELISA檢測過程中，經常會遇到這樣的問題：
樣本測定OD值超過標曲最高點OD值，造成測定數據無法直接使用。樣本必須進行稀釋，如何確定測定樣本的稀釋倍數？咱們先了解下 樣本稀釋容易犯的錯誤有哪些？
1、稀釋不足。稀釋倍數不足時，容易導致最終結果偏小。
2、過度稀釋。過度稀釋時，容易導致最終結果偏大。
3、稀釋不夠規范，引入很多人為偏差。稀釋不夠規范，特別是大比例稀釋時，人為偏差大大增加。
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