熔解曲線的介紹及熔解曲線問題分析
熔解曲線介紹
熔解曲線是通過評估雙鏈DNA的溫度依賴性解離來確定檢測的特異性。當使用嵌合熒光染料（如SYBR Green或EVA Green）時，運行熔解曲線可確定在qPCR反應中是否擴增出單一產物。
典型的熔解曲線步驟，通常從60℃增加到95℃使反應樣品緩慢變性，同時每0.1-0.5℃逐步收集熒光。隨著溫度的逐漸升高，雙鏈DNA會逐漸解鏈成單鏈，嵌入到雙鏈DNA小溝上的熒光染料分子也會逐漸脫落下來，熒光強度隨之逐漸下降。熒光強度的累積數據點與溫度的關系曲線就是熔解曲線的原始圖譜。在到達某個溫度時，DNA雙鏈解開一半，且熒光強度驟然下降，該溫度即稱為熔解溫度（Tm）。當擴增子達到Tm時，熒光強度會突然下降，這與擴增子長度和GC含量有關。
qPCR軟件通常會顯示熔解曲線的一階導數圖譜，使得熔解曲線在給定擴增子的特定熔解溫度（Tm）處產生峰值，用這個特征峰就可以將特異產物與其它產物（如引物二聚體）區分開，因為它們在不同的溫度熔解。所以，熔解曲線中出現多個或移動的峰值可能反映引物特異性、DNA交叉污染、引物二聚體或基因組DNA污染等相關問題。
圖1：熔解曲線分析。A)：通過熔解曲線分析來確定PCR產物的熔解溫度（Tm）。B)：單峰是必要的，以確保只有一個給定產物被引物對擴增。產生次級產物或引物二聚體會改變qPCR的效率，影響結果的準確性、精密度和可重復性。
當一些雙鏈非特異性產物在反應中擴增時，嵌合熒光染料會與它們結合，導致qPCR反應的熒光強度增加，使反應效率提高到100%以上。這會導致Cq值低于預期，目標DNA的估計值過高，進而影響數據和結論的準確性。因此，在未知樣品、無模板對照（NTC）、無反轉錄酶對照（NRT），以及陽性和陰性對照樣品上運行熔解曲線是至關重要的，以確保檢測到單峰。
熔解曲線問題分析
前峰、偏峰或多峰都是反應中積累非特異性產物的強烈信號，在進行模板定量分析之前需要進一步排查問題（圖2）。
在進行熔解曲線分析時，重要的是在第一次使用時驗證所有引物對，通過在瓊脂糖凝膠上運行最終的PCR產物，以確保觀察到的熔解峰與預期的目標產物大小相對應。雖然熔解曲線/峰是特異性的強指標，但需要注意的是，一些長度和序列相似的靶標可能具有相同的熔解曲線。此外，不同樣品中存在的不同試劑、不同的離子強度和隨機污染物可能會導致觀察到的熔解峰發生偏移，即使所需的靶標已被高特異性擴增（圖3）。
當反應中積累多種產物時，也會觀察到異常的熔解峰，例如脫靶引物形成的多個產物、引物二聚體或引物發夾形成的多個產物。反應中的多種產物會產生相應數量的、通常不同的熔解峰，每個峰都集中在不同的溫度上（圖3）。在某些情況下，多個產物會出現雙峰或前峰。引物二聚體或發夾通常會在比全長引物更低的溫度下出現。
有時，某些擴增子即使沒有其他產物，也會產生雙峰。當擴增子序列中不同區域的GC含量差異很大時，就會出現這種情況。這種堿基對含量的不均勻會導致低GC區域先發生部分變性，然后富含GC的區域在較高溫度下發生變性，最終出現兩個不同的峰值。哺乳動物CFTR基因就是一個明顯的例子。雖然這種現象很少見，但在進行qPCR分析時仍需注意。
QX系列實時熒光定量PCR系統
QX系列實時熒光定量PCR系統，采用先進的雙PID算法和溫控技術，結合免維護光學系統和靈活的連接操控方式。這不僅提供了更快的升降溫速度，同時還帶來了更好的溫控精準度和均一性，以確保您實驗數據的準確性和可靠性。配合業界領先的熒光定量PCR數據處理軟件，QX系列將熒光信號處理、專業的數據計算方法、嚴謹的統計學分析功能整合為一站式解決方案，從核酸到蛋白研究，滿足探索各種科學問題的實驗需要，重新定義了科研級熒光定量PCR系統。
熔解曲線是通過評估雙鏈DNA的溫度依賴性解離來確定檢測的特異性。當使用嵌合熒光染料（如SYBR Green或EVA Green）時，運行熔解曲線可確定在qPCR反應中是否擴增出單一產物。
典型的熔解曲線步驟，通常從60℃增加到95℃使反應樣品緩慢變性，同時每0.1-0.5℃逐步收集熒光。隨著溫度的逐漸升高，雙鏈DNA會逐漸解鏈成單鏈，嵌入到雙鏈DNA小溝上的熒光染料分子也會逐漸脫落下來，熒光強度隨之逐漸下降。熒光強度的累積數據點與溫度的關系曲線就是熔解曲線的原始圖譜。在到達某個溫度時，DNA雙鏈解開一半，且熒光強度驟然下降，該溫度即稱為熔解溫度（Tm）。當擴增子達到Tm時，熒光強度會突然下降，這與擴增子長度和GC含量有關。
qPCR軟件通常會顯示熔解曲線的一階導數圖譜，使得熔解曲線在給定擴增子的特定熔解溫度（Tm）處產生峰值，用這個特征峰就可以將特異產物與其它產物（如引物二聚體）區分開，因為它們在不同的溫度熔解。所以，熔解曲線中出現多個或移動的峰值可能反映引物特異性、DNA交叉污染、引物二聚體或基因組DNA污染等相關問題。
當一些雙鏈非特異性產物在反應中擴增時，嵌合熒光染料會與它們結合，導致qPCR反應的熒光強度增加，使反應效率提高到100%以上。這會導致Cq值低于預期，目標DNA的估計值過高，進而影響數據和結論的準確性。因此，在未知樣品、無模板對照（NTC）、無反轉錄酶對照（NRT），以及陽性和陰性對照樣品上運行熔解曲線是至關重要的，以確保檢測到單峰。
熔解曲線問題分析
前峰、偏峰或多峰都是反應中積累非特異性產物的強烈信號，在進行模板定量分析之前需要進一步排查問題（圖2）。
圖2：尾峰和前峰的例子，表明有引物二聚體的存在。
在進行熔解曲線分析時，重要的是在第一次使用時驗證所有引物對，通過在瓊脂糖凝膠上運行最終的PCR產物，以確保觀察到的熔解峰與預期的目標產物大小相對應。雖然熔解曲線/峰是特異性的強指標，但需要注意的是，一些長度和序列相似的靶標可能具有相同的熔解曲線。此外，不同樣品中存在的不同試劑、不同的離子強度和隨機污染物可能會導致觀察到的熔解峰發生偏移，即使所需的靶標已被高特異性擴增（圖3）。
圖3：偏移或雙峰的例子，表明非特異性產物擴增。
當反應中積累多種產物時，也會觀察到異常的熔解峰，例如脫靶引物形成的多個產物、引物二聚體或引物發夾形成的多個產物。反應中的多種產物會產生相應數量的、通常不同的熔解峰，每個峰都集中在不同的溫度上（圖3）。在某些情況下，多個產物會出現雙峰或前峰。引物二聚體或發夾通常會在比全長引物更低的溫度下出現。
有時，某些擴增子即使沒有其他產物，也會產生雙峰。當擴增子序列中不同區域的GC含量差異很大時，就會出現這種情況。這種堿基對含量的不均勻會導致低GC區域先發生部分變性，然后富含GC的區域在較高溫度下發生變性，最終出現兩個不同的峰值。哺乳動物CFTR基因就是一個明顯的例子。雖然這種現象很少見，但在進行qPCR分析時仍需注意。
QX系列實時熒光定量PCR系統
QX系列實時熒光定量PCR系統，采用先進的雙PID算法和溫控技術，結合免維護光學系統和靈活的連接操控方式。這不僅提供了更快的升降溫速度，同時還帶來了更好的溫控精準度和均一性，以確保您實驗數據的準確性和可靠性。配合業界領先的熒光定量PCR數據處理軟件，QX系列將熒光信號處理、專業的數據計算方法、嚴謹的統計學分析功能整合為一站式解決方案，從核酸到蛋白研究，滿足探索各種科學問題的實驗需要，重新定義了科研級熒光定量PCR系統。
基于JLM qPCR平臺的熔解曲線分析
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