摘要:用D-半乳糖(D-gal)建立衰老動物模型且海馬內微注射βAP ,檢測各組大鼠開場行為、Y-迷宮分辨學習和一次性被動回避反應的變化的方法,研究β-淀粉樣蛋白(βAP)對衰老大鼠開場行為及學習記憶能力的影響. 結果是D-gal + NS組、D-gal +βA P組大鼠在新異環境中自發活動和探究行為減少,學習記憶減退,與NS + NS組比較有顯著性差異( P< 0. 05 ,P< 0. 01) . 該文得出的結論是βAP與D-gal聯合使用可導致腦老化程度加重,學習記憶能力顯著減弱.

關鍵詞:β-淀粉樣蛋白; 開場行為; 學習記憶; 衰老　　

β-淀粉樣蛋白(β- amyloidp rotein ,βAP)是老年性癡呆患者的大腦中特有的一種蛋白,它在老年性癡呆的發病機理中的作用已引起人們的重視. 生化研究表明,β-淀粉樣蛋白是老年性癡呆患者腦海馬和皮層老年斑(SP)的主要成分,它與AD的病理形成過程關系密切. 已有報道βA P對正常大鼠海馬神經元的毒害作用,但有關βAP對衰老大鼠的作用,國內外均未見報道,本實驗試圖在D-半乳糖所致衰老動物模型基礎上進行海馬內注射βAP ,觀察其對大鼠開場行為和空間分辨學習以及記憶保持能力的影響.

    1　材料與方法

1 . 1　動物和試劑

雄性健康SD大鼠,體重100～120g(江蘇省實驗動物中心提供) , βA P為Sigma公司產品(βA P1 -40 ,Lot NO. 76 H49611) ,D-半乳糖(D-gal) 為上海試劑二廠產品.

1 . 2　分組和模型建立

將大鼠隨機分成4組: ①生理鹽水N S + N S組; ②N S +βA P組; ③D-gal + N S組; ④D-gal +βA P組- 1連續注射6周建立衰老動物模型; ①、②組. ③、④組動物腹腔注射D-半乳糖:50 mg·kg- 1d動物腹腔注射等量生理鹽水. 于第4周進行雙側海馬內注射βA P ,每側注射1μL(4μg/μL) ;對照組注射等量生理鹽水. 海馬定位注射方法:大鼠腹腔注射4 %戊巴比妥鈉(40 mg. kg-1)麻醉,立體定位儀(日本NARISHIGESN - 3型)上固定,坐標按照圖譜,以前囪定位: A P = - 3 . 5 mm , ML = ±2 . 0mm , H = 2 . 7 mm ,鉆開顱骨,用微量進樣器垂直進針,每側注射時間為5min ,留針5min ,緩慢起針,局部消毒后縫合皮膚,肌注抗生素抗感染.

1 . 3　行為學檢測

連續腹腔內注射6周后進行.

1 . 3 . 1　開場行為(open field):將動物置于圓形開場檢測箱底中央的格內,記錄其在3 min跑動(locomotion)穿過的格數,后肢站立(rearing)次數、梳理(grooming)次數及糞便顆粒數. 比較不同組間大鼠在新異環境中自發行為和探究行為表現的差異.

1 . 3 . 2　Y -迷宮分辨學習(Y- maze discrimination learning)能力檢測Y-迷宮為三等分輻射式反射箱. 以大鼠被電擊

后逃至安全區為一次正確反應,連續10次測試中有9次(90 %)正確反應,定為學會標準. 記錄每個大鼠達到學會標準的訓練次數. 所有檢測過程均由計算機完成.

1 . 3 . 3　一次性被動回避反應(o ne- t rial passiveavoidance respo nse)根據大鼠趨暗習性,記錄其在通道上的停留時間,即步入潛伏期(step-t hrough latency , STL) ;動物進入暗箱后立即給予電擊(0 . 3 mA ,5 s) ; 24 h 后檢測大鼠的S TL .以S TL作為記憶保持的指標, S TL越長表明對電擊的記憶保持越好. 檢測以240 s為限.本實驗數據用( X±SŠX( X表示,組間差異用t檢驗;一次性被動回避反應采用Mann- whit ney非參數檢驗

    2　結 　　果

2 . 1　不同組大鼠開場行為觀察結果見表1 ,統計處理表明,在開場行為諸參數中,D-gal +βAP組動物與NS + NS組比較糞便顆粒數有顯著性差異( P< 0 . 05) ,而跑動格數則極明顯減少( P< 0 . 01) ,前者在新異環境中自發活動和探究反應明顯下降,緊張恐懼狀態也降低. D-gal + NS組動物跑動格數與NS + NS組比較也有顯著性差異( P< 0 . 05). NS + NS組與NS +βA P組之間雖無顯著性差異,但其跑動格數、站立次數均有下降趨勢,說明βA P單獨使用對大鼠在新異環境中的自發活動及探究行為也有一定影響.

2 . 2 　Y-迷宮分辨學習能力檢測

達到學會標準所需訓練的次數, N S + N S 組:21 . 4±2 . 6 ;N S +βAP組:34 . 6±5 . 5 ;D-gal + NS組:42 . 4±5 . 4 ;D-gal +βA P組:48 . 0±5 . 6 . 前兩者比較無顯著性差異( P> 0 . 05) ,D-gal + NS組與NS + N S組比較有顯著性差異( P< 0 . 05) ,而D-gal +βPA組與N S + N S組比較,達到學會標準所需訓練次數極明顯增加( P< 0 . 01) ,說明D-gal所致衰老模型大鼠的分辨學習能力顯著降低,而在衰老動物模型上海馬內注射βAP更使學習能力極顯著下降.

2 . 3　一次性被動回避反應

D-gal +βAP組記憶保持能力明顯下降,電擊后24 hSTL顯著縮短,與NS + NS組和D-gal + NS組比較有顯著性差異( P< 0 . 05). 其他組之間比較,差異無顯著性,但記憶保持能力呈逐漸降

低趨勢

    3　討 　　論

有研究報道,對大鼠連續注射D-半乳糖引起擬衰老效應,可導致動物學習記憶能力下降,腦內

超氧陰離子自由基水平增高, 超氧化物歧化酶(SOD)活性降低,丙二醛和脂褐素含量升高. 這說

明D-半乳糖誘發的自由基蓄積引起的脂質過氧化損傷,是產生擬衰老變化的原因,這必然也會引起衰老性腦功能的衰退.βAP是老年性癡呆患者最早出現的典型的病理學特征. 一些學者認為, βAP可引起學習記憶減退、認知障礙等是AD各種病理和臨床表現的始發因素. βAP具有沉積作用和神經毒性,較高濃度的βAP能引起神經退化和死亡;βAP的神經毒性作用可以增強或加大各種傷害性刺激的細胞損傷效應,此外它還具有直接的細胞毒性. 但Morimoto報道,在大鼠海馬神經元,單獨注射βAP不能產生特定的神經毒性作用,僅能引起少量的神經元變性. 無論在體外培養細胞,還是在體內研究中,βAP是否具有神經毒性作用還存在著爭議,其原因可能是所用βAP的濃度不同所致.

. 本研究結果

表明海馬內單獨注射βAP不能引起明顯的行為學變化,但在衰老動物模型基礎上經βAP處理后,可導致動物自發活動及學習記憶行為明顯降低,說明D-半乳糖和βAP有疊加效應. 學習記憶是腦的高級功能,學習記憶減退是腦功能衰退的表現. 因此,本實驗結果提示,在D-半乳糖所致衰老動物基礎上,海馬內注射βAP ,可望作為更接近AD的一種動物模型. 但它是否具有AD的各種病理學特征,還有待于做進一步研究