聶愛英

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

Q-Exactive；單抗藥物；輕重鏈分子質量

 

現在，越來越多的生物制藥公司開始使用 Orbitrap 類型的質譜進行單抗藥物的表征分析，包括完整分子質量、輕重鏈分子質量、肽圖、糖鏈、二硫鍵、宿主蛋白殘留等等。基于分子質量測定的方法更加快速和直接，尤其是通過單抗輕重鏈分子質量測定的方法，不僅可以得到分子質量的信息，而且可以獲得和輕重鏈相關的二硫鍵信息、部分氨基酸后修飾位點的信息，糖基化結合位置的信息、ADC 結合位置的信息等等，同時，相對于完整分子質量的分析，單抗輕重鏈分子質量測定可以幫助客戶獲得更加細化和準確的信息。在實際樣品分析的過程中，我們可以通過優化色譜分離條件、質譜分析條件來獲得最佳的輕重鏈分子質量譜圖和相關信息。

 

目前，基于 Orbitrap 類型的 Q-Exactive 系列、LTQ-Orbitrap 系列、Orbitrap-Fusion 系列的質譜儀器都可以進行各種類型的單抗表征分析，在這里我們以 Q-Exactive plus 儀器為測試平臺，進行了單抗輕重鏈分子質量分析的色譜和質譜參數優化，相似的參數可以直接應用到其它基于 Orbitrap 類型的質譜儀器上，為生物制藥客戶的實際樣品分析提供了參考依據。

 

質譜儀器：Q-Exactive plus（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Dionex 3000 液相色譜系統（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：Agilent Zorbax 300，SB-C8, 3 μm，2.1×50 mm；

試劑：二次去離子水，色譜級乙腈，色譜級甲酸，DTT（Sigma-Aldrich）。

 

1 mg/mL 的 Herceptin 及其脫糖形式的單抗溶液，在保證 DTT 終濃度 20 mM 的條件下，37℃ 反應 2 小時，然后直接用于后續色譜質譜分析。

2.3 色譜質譜分析方法

色譜分析條件：具體見表 1；

 

表 1. 輕重鏈分子質量測定的色譜分析條件

 

（備注：該應用報告中，使用了 2 種不同的色譜梯度，10 分鐘和 15 分鐘，括號中為 15 分鐘色譜梯度的設置參數。）

 

質譜分析條件：具體見表 2；

 

表 2. 輕重鏈分子質量測定的質譜分析條件

 

采用 Protein Deconvolution 4.0 軟件對原始質譜圖進行去卷積處理，幾個重要的參數需要進行調節，1）Target Mass：輕鏈為 23000 Da，重鏈為 46000 Da；2）Minimum Adjacent Charge：6 to 10；3）Mass Tolerance：20 ppm；4）Noise Rejection：99% confidence；5）m/z range：根據原始質譜圖中的信號分布進行調整；6）Output Mass Range：根據 target mass 進行調整，最后得到單抗輕重鏈去卷積后的分子質量信息。

 

影響蛋白分子量測定的因素有很多，包括：流動相、溶液體系（不揮發性鹽）、雜質成分、樣品濃度、pH 值、樣品在源內分解或碎裂、質譜分辨率等情況。在單抗輕重鏈測定的過程中，我們也會考慮到這些因素，一般我們選用 0.1% 甲酸的水溶液和 0.1% 甲酸的乙腈溶液作為流動相；如果單抗原溶液中含有不揮發性鹽，我們建議進行脫鹽處理，比如說使用超濾管脫鹽，同時如果含有 SDS、Tween 等表面活性劑或者去垢劑最好也進行超濾或者使用其它表面活性劑和去垢劑去除試劑盒進行去除；如果含有雜質成分，也需要根據雜質的組成和性質進行雜質去除；樣品的濃度不能太低，否則信噪比低，造成質量誤差增大。以上這些參數主要同樣品前處理相關，需要作樣人員在質譜分析前進行前處理制備。而對于在質譜分析中，可以調節的參數主要是源內碎裂能量（SID），在這里我們就一起探討一下該參數對輕重鏈分子質量的影響。

 

詳細質譜參數如表 2 所示，源內碎裂能量（SID）使用 0/30/50/70 和 100 eV 五個不同的電壓參數進行數據的采集，輕鏈的原始質譜圖如圖 1 所示，重鏈的原始質譜圖如圖 2 所示，從圖 1 和圖 2 中，我們可以看到，隨著 SID 能量的增加，輕重鏈的質荷比分布向高質量端移動，并且在 70 eV 的時候發生了顯著的質荷比移動和信噪比的降低，這主要是由于施加的電壓增大，輕重鏈發生降解的可能性增多，以致質譜峰信噪比降低，峰強度降低，而輕鏈相對分子量比較小，比較簡單，因此信號改變不是很明顯，但對于重鏈，我們可以很明顯的觀察到這個現象。因此在實際樣品的測試中，考慮到信噪比和強度這兩個重要的因素，我們可以在 0–50 eV 的電壓值下進行優化（當然也不排除樣品特殊的情況下，我們也可以提高 SID 值進行優化），在 Herceptin 樣品的測試中，我們選擇 30 eV 進行后續的樣品采集和進一步的色譜條件優化。

 

圖 1. Q-Exactive 質譜采集的單抗輕鏈原始質譜圖（SID 代表源內碎裂能量，右上角的數字代表峰強度）

 

 

圖 2. Q-Exactive 質譜采集的單抗重鏈原始質譜圖（SID 代表源內碎裂能量，右上角的數字代表峰強度）

 

3.2 液相色譜梯度的優化

在樣品初步測試的過程中，我們使用 10 分鐘的色譜梯度進行樣品測試，得到的 LC-MS 色譜質譜圖如圖 3 所示，可以看到輕重鏈在同一個色譜峰中出峰，沒有實現完全的分離，不過從質譜圖中可以看到，色譜峰的前半部分為輕鏈，后半部分為重鏈，可以實現輕重鏈的分子質量測定。在不考慮時間限制的情況下，可以適當的延長色譜梯度，實現輕重鏈的完全分離，如圖 4 所示，輕重鏈的色譜洗脫梯度主要在乙腈相 20%–50%，延長該段時間到 5 分鐘，延長總色譜梯度時間到 15 分鐘，就可以實現輕重鏈的完全分離。

 

圖 3. Q-Exactive 質譜采集的 10 分鐘色譜梯度的單抗輕重鏈色譜質譜圖

 

圖4 Q-Exactive質譜采集的15分鐘色譜梯度的單抗輕重鏈色譜質譜圖

 

 

基于以上的色譜和質譜條件優化，以 SID 為 30 eV 和色譜時間為 15 min，完整和脫糖 Herceptin 的輕鏈 LC-MS 以及原始質譜圖如圖 5 所示，相應的去卷積質譜鏡像圖如圖 6 所示，可以看到輕鏈的平均分子質量為 23438 Da；相應的重鏈 LC-MS 以及原始質譜圖如圖 7 所示，相應的去卷積質譜鏡像圖如圖 8 所示，可以看到脫糖重鏈的平均分子質量為 49149 Da，完整 Herceptin 的糖型主要存在形式為 2G0F 和 G0F+G1F。

 

圖 5. Q-Exactive 質譜采集的 15 分鐘色譜梯度的完整和脫糖 Herceptin 的輕鏈色譜質譜圖

 

圖 6. Q-Exactive 質譜采集的 15 分鐘色譜梯度的完整和脫糖 Herceptin 的輕鏈去卷積分子質量鏡像圖

 

圖 7. Q-Exactive 質譜采集的 15 分鐘色譜梯度的完整和脫糖 Herceptin 的重鏈色譜質譜圖

 

圖 8. Q-Exactive 質譜采集的 15 分鐘色譜梯度的完整和脫糖 Herceptin 的重鏈去卷積分子質量鏡像圖

 

本文基于 Q-Exactive plus 質譜平臺，主要優化了源內碎裂能量（SID）這一質譜參數和色譜洗脫梯度，從而實現了單抗輕重鏈有效的色譜分離和高信噪比的質譜測定，為藥物開發、生產和質檢過程中的單抗輕重鏈分析提供了直接的實驗方法，同時相似的質譜參數也可以應用到其它基于 Orbitrap 類型的質譜儀器上，為廣大的生物制藥客戶提供了單抗樣品輕重鏈快速分析的參考依據。