植物Rubisco活性測定試劑盒說明書
植物Rubisco活性測定試劑盒
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組分貨號 |
名稱 |
規格 |
貯存 |
運輸 |
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PU1060-01 |
試劑1-Rubisco提取緩沖液（2×） |
100 ml |
4℃ |
常溫 |
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PU1060-02 |
試劑2-10×Assay buffer |
15 ml |
-20℃ |
常溫 |
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PU1060-03 |
試劑3-GAPDH（200×） |
1 KU |
-20℃ |
常溫 |
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PU1060-04 |
試劑4-PGK（100×） |
500 U |
4℃ |
常溫 |
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PU1060-05 |
試劑5-CPK（100×） |
1 KU×2 |
-20℃ |
常溫 |
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PU1060-06 |
試劑6-ATP（100×） |
1.2 ml |
-20℃ |
常溫 |
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PU1060-07 |
試劑7-CrP（100×） |
1.2 ml |
-20℃ |
常溫 |
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PU1060-08 |
試劑8-NADH（100×） |
1.2 ml |
-20℃ |
常溫 |
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PU1060-09 |
試劑9-RuBP |
1.4 ml×2 |
-20℃ |
常溫 |
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PU1060-10 |
試劑10-酶溶解緩沖液 |
5 ml |
-20℃ |
常溫 |
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DE005 |
試劑11-滅菌水 |
100 ml |
4℃ |
常溫 |
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BSA-02 |
試劑12-BSA溶液 50mg/ml |
5 ml |
-20℃ |
常溫 |
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DT0140P |
試劑13-1MDTT（100×） |
1 ml×2 |
-20℃ |
常溫 |
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PC2030-01 |
蛋白酶抑制劑 植物樣品提取用(100×) |
1 ml |
-20 |
常溫 |
● 產品簡介：
核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是光合作用碳代謝中的重要的調節酶，是植物中最豐富的蛋白質，主要存在于葉綠體的可溶部分，總量約占葉綠體可溶蛋白50％～60％。
這里1分子CO2被固定，就有2分子 NADH 被氧化。因此，由NADH氧化的量就可計算Rubisco的活性，由340nm吸光度的變化可計算NADH氧化的量。
為了使NADH的氧化與CO2的固定同步，需要加入磷酸肌酸(CrP)和磷酸肌酸激酶(CPK)的ATP再生系統。
按照一次使用0.5 ml 試劑1-Rubisco提取緩沖液（2×）計算，試劑盒可以測定200個樣品。
● 自備材料：
植物材料；剪刀；液氮；研缽或其他研磨設備；1.5ml離心管；1ml石英比色皿；紫外分光光度計；制冰機；低溫離心機
● 操作步驟：
一、 即用型Rubisco提取緩沖液配制：
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一個反應配制體積 |
n個反應配制體積 |
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1 ml |
n×1 ml |
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Rubisco提取緩沖液（2×） |
0.5 ml |
n×0.5 ml |
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滅菌水 |
470 μl |
n×470 μl |
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1 M DTT（100×） |
10 μl |
n×10 μl |
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BSA溶液50mg/ml |
20 μl |
n×20μl |
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蛋白酶抑制劑（100×） |
10 μl |
n×10μl |
注：1. 即用型Rubisco提取緩沖液盡量現配現用，短期4℃中可以過夜保存。
2. 為增強Rubisco的穩定性，提取緩沖液中可以加入蛋白酶抑制劑（Cat：PC2030）
二、 Rubisco樣品提取：
1. 取新鮮植物組織，清洗干凈，擦干，液氮中研磨，1 cm2葉片（1分硬幣大小）或0.1g粉末加入1 ml 即用型Rubisco提取緩沖液，顛倒混勻，冰浴放置5-10分鐘。
2.12000g4℃離心 10分鐘，上清即為Rubisco樣品提取液，常溫放置備用（不要冰浴或4℃放置，常溫放置可以保持Rubisco活性）。
注：Rubisco樣品提取液最好立即測定，不建議保存。
三、 Rubisco活性測定分析：
1. 即用型酶溶解緩沖液配制：
按照標簽所示，在試劑10-酶溶解緩沖液原瓶中加入1.5 ml滅菌水和1 ml BSA溶液（50mg/ml），混勻后即配成即用型酶溶解緩沖液，冰浴備用，-20℃保存。
2. 試劑3-GAPDH和試劑5-CPK按照標簽所示加入即用型酶溶解緩沖液，混勻溶解后冰浴備用，-20℃保存。
3. 試劑4-PGK為硫酸銨懸浮液，4℃12000g離心5分鐘，去除上清（小心去除，可以保留少許上清，不要吸棄沉淀），沉淀中按照標簽所示加入即用型酶溶解緩沖液，混勻溶解后冰浴備用，-20℃保存。
4. 試劑9-RuBP：按照標簽所示加入滅菌水，徹底混勻后冰浴備用。
注：RuBP溶液穩定性較差，用后-20℃保存，有效期3-4天，長期-80℃保存。
5. 試劑8-NADH：按照標簽所示加入滅菌水，徹底混勻后冰浴備用。
注：NADH穩定性較差，用后-20℃貯存3-4天，長期-80℃保存。
6. 反應體系MasterMix配制：
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加入順序 |
組份 |
1ml反應體系加入量 |
MasterMix配制 （測定n個樣品為例） |
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1 |
10×Assay Buffer |
100 μl |
n×100μl |
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2 |
滅菌水 |
795μl |
n×795μl |
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3 |
ATP溶液（100×） |
10 μl |
n×10μl |
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4 |
CrP溶液（100×） |
10 μl |
n×10 μl |
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5 |
GAPDH溶液（200×） |
5 μl |
n×5 μl |
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6 |
PGK溶液（100×） |
10 μl |
n×10 μl |
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7 |
CPK溶液（100×） |
10 μl |
n×10 μl |
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8 |
NADH溶液（100×） |
10 μl |
n×10 μl |
7. 反應體系測定；
1.5 ml離心管中配制以下反應。
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1 |
2 |
3 |
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對照反應 |
初始活性測定 |
總活性測定 |
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MasterMix |
950 μl |
950 μl |
950 μl |
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即用型Rubisco提取緩沖液 （步驟一） |
25 μl |
- |
- |
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Rubisco樣品提取液 （步驟二） |
- |
25μl |
25μl 常溫放置15分鐘 |
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試劑9-RuBP溶液 |
25 μl |
25 μl |
25μl |
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加入RuBP后立即測定OD340讀數，記錄60秒內OD340值變化。 |
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注：一般分光光度計OD340讀數在0.5-3之間數據比較準確，低于此范圍說明提取用的材料太少，Rubisco活性太低；高于此范圍說明所用材料太多，Rubisco活性太高，此時可以將Rubisco樣品提取液用即用型Rubisco提取緩沖液稀釋后測定。
四、Rubisco活性計算：
根據如下公式計算樣品中Rubisco活初始性和總活性：
Activity（μmol·m-2·S-1）-表示每秒每平方米葉片有多少μmol NADH被氧化
△A-反應最初1分鐘內340nm處測定管吸光度變化的絕對值
N-稀釋倍數，本程序中為40（1 ml提取液，取25μl測定）。
6.22-每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數
d-cm 比色皿光程，一般為1
△t-秒 測定時間，本程序為60秒
S-cm2 提取時使用的葉面積
