NextSeq1000、NextSeq2000和NextSeq550測序系統之間的數據一致性
簡介/Introduction
在過去的20年里，Illumina引領了新一代測序（NGS）技術的變革，使探索基因組、轉錄組和表觀基因組變得更簡單，也更經濟。Illumina推出的最新平臺NextSeq 1000和NextSeq 2000測序系統，提供了突破性的系統設計、創新的化學測序技術、可兼顧多種文庫制備方法的高兼容性，以及機載集成式生信分析軟件。
NextSeq 1000和NextSeq 2000測序系統均采用Illumina邊合成邊測序（SBS）化學技術，該技術支持包括NextSeq 550系統在內的所有Illumina平臺。Illumina SBS化學技術生成了全球90%以上的測序數據1，該技術可大大減少錯誤read2，實現了全基因組范圍內的可靠堿基檢出3。
NextSeq 1000和NextSeq 2000系統經過優化后增強了簇亮度，減少了通道串擾，并提高了信噪比。NextSeq 1000和NextSeq 2000測序系統結合了光學和儀器設計領域的最新技術，提高了數據輸出量，降低了每次運行的成本，同時生成用戶所期待的，與NextSeq 550系統一樣的高質量數據。
本應用說明表明NextSeq 1000和NextSeq 2000測序系統在關鍵應用（包括外顯子組、群體細胞和單細胞RNA基因表達）中可呈現出與NextSeq 550系統相當的數據質量。
方法/Methods
外顯子組測序
使用Nextera™ DNA Flex Pre-Enrichment Library Prep and Enrichment Reagents Kit（Illumina，貨號 20025524）從NA12878基因組 DNA（gDNA）（Coriell醫學研究所）樣本中制備外顯子組文庫，再由Illumina Exome Panel（Illumina，貨號 20020183）捕獲其中的目標基因組區域。
使用NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Kit（200 個 循 環 ）（Illumina 貨號 20040557）在 NextSeq 2000*系統上測序，運行配置為 2×100 bp。為了進行比較，使用NextSeq 500/550 High-Output Kit v2.5（300 個循環）（貨號 20024908）在NextSeq 550系統上對相同文庫進行測序，運行配置為 2×100bp。每臺儀器在單次運行中可對 8 個樣本進行多重測序。
*盡管 NextSeq 2000系統的通量高于 NextSeq 1000系統，但兩者的性能和數據質量不相上下。因此，本應用說明中僅選用NextSeq 2000系統進行數據比較研究。
使用DRAGEN™ Enrichment Pipeline v3.4進行二級數據分析，它可在NextSeq 2000系統上運行或通過BaseSpace™ Sequence Hub運行。根據 Platinum Genomes 2016 v1.0數據集評估變異檢出的準確性4。
群體細胞mRNA測序
使用TruSeq™ Stranded mRNA Library Prep Kit（Illumina，貨號20020594）從通用人類參比 RNA（Coriell 醫學研究所）樣本中制備信使RNA（mRNA）文庫。
使用NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Kit（200 個循環）在NextSeq 2000系統上對其測序，運行配置為 2×76bp。為了進行比較，使用NextSeq 500/550 High-Output Kit v2.5（300 個循環）在 NextSeq 550系統上對相同文庫進行測序，運行配置為 2×76 bp。每臺儀器在單次運行中可對24個樣本進行多重測序。
使用DRAGEN RNA Pipeline v3.5.112進行二級數據分析，它可在NextSeq 2000系統或BaseSpace Sequence Hub上運行。數據與基因組參照序列聯盟的人類標準基因GRCh38（組裝 h38）進行比對。
單細胞RNA測序
單細胞RNA測序（scRNA-Seq）的樣本是用4重外周血單核細胞（PBMC）制備的，后者從單個供體的全血中分離而來。使用Chromium Single Cell Gene Expression v3 Solution（10x Genomics，貨號1000092）在Chromium Controller（10x Genomics，貨號 120223）上從約1000個PBMC中制備文庫。
使用NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Kit（200 個循環）在NextSeq2000系統上對其測序。為了進行比較，使用NextSeq 500/550 High-Output Kit v2.5（150 個循環）（Illumina，貨號20024907）在NextSeq 550系統上對相同文庫進行測序。根據10x Genomics提供的參數設置運行配置：read 1 28個循環，index read 8個循環，read 2 91個循環。
使用Cell Ranger scRNA-Seq分析流程（10x Genomics公司）進行數據分析，以比對read、成簇和分析基因表達。
結果/Results
外顯子組測序
評估包括單核苷酸位點變異（SNV）和插入 / 缺失（indel）的查準率和查全率、運行輸出數據量（產量）、錯誤率、匹配read百分比、平均靶點覆蓋深度和覆蓋度均一性在內的初級和二級分析指標。NextSeq 550和NextSeq 2000系統在測序數據輸出量和數據質量方面都超過了公布的技術規范，兩個測序平臺都保有出色的測序性能（表1）。這些數據表明，NextSeq 2000系統和 NextSeq 550系統的外顯子組測序結果不相上下，兩個平臺都能提供高質量的數據和高度準確的變異檢出。
表1：外顯子組測序性能相當
群體細胞mRNA測序
NextSeq 550和NextSeq 2000系統在測序數據輸出量和數據質量方面都超過了公布的技術規范（表2）。通過群體細胞mRNA-Seq對特定RNA靶點進行定量，結果表明在四次重復實驗中兩個平臺之間具有良好的一致性（R2>0.99）（圖1）。這些數據證實了在定量 mRNA 表達水平時，NextSeq 2000系統生成的數據質量與NextSeq 550系統相當。
表2：群體細胞mRNA-Seq性能相當
圖1：高度一致的mRNA-Seq結果——使用NextSeq 550系統通過細胞群mRNA-Seq 對特定 RNA 靶點進行定量，并繪制在 y 軸上。NextSeq 2000 系統的結果繪制在 x 軸上。沿著 y = x 趨勢線觀察數據的一致性（四次重復試驗的R2>0.99）。
單細胞全轉錄組測序
NextSeq 550和 NextSeq 2000系統在測序數據輸出量和數據質量方面都超過了公布的技術規范（表3）。在 scRNA-Seq 中使用獨特分子標簽（UMI）對單個細胞進行定量，結果表明在四次重復實驗中兩個平臺之間具有良好的一致性（R2>0.99）（圖2）。這些數據進一步證明在開展 scRNA-Seq 研究時，NextSeq 2000系統生成的數據質量與NextSeq 550 系統相當。
表3：scRNA-Seq性能相當
圖2：scRNA-Seq結果高度一致——使用 NextSeq 550 系統通過 scRNA-Seq 對單個細胞（UMI）進行定量，并繪制在 y 軸上。NextSeq 2000 系統的結果繪制在 x 軸上。沿著 y = x 趨勢線觀察數據的一致性（四次重復試驗的 R2>0.99）。
總結/Summary
NextSeq 1000和NextSeq 2000測序系統具有突破性的系統設計、創新的化學測序技術并且機載生信分析軟件，徹底改變了臺式測序系統的性能。這些平臺降低了測序成本并提高了運行能力，同時保持了用戶對Illumina期望的高質量數據。將常在NextSeq 550 系統上運行的關鍵應用數據，包括外顯子組、群體細胞mRNA和單細胞 RNA 測序，直接與NextSeq 2000系統生成的數據進行比較。結果顯示，NextSeq 550和NextSeq 2000系統的性能高度一致，反映了 Illumina對始終提供一致、高質量的測序性能的承諾。
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如需下載本說明中提及的數據集，請訪問：basespace.illumina.com/datacentral
僅供研究使用。不得用于診斷。
參考文獻
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Data calculations on file. Illumina, Inc. 2017.
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Based on a comparison of the top three industry-leading NGS platforms. Data calculations on file. Illumina, Inc. 2016.
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Ross MG, Russ C, Costello M, et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biol. 2013;14:R51.
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Eberle MA, Fritzilas E, Krusche P, et al. A reference data set of 5.4 million phased human variants validated by genetic inheritance from sequencing athree-generation 17-member pedigree. Genome Res. 2017;27:157–164.
