固有柔腦膜側支化對缺血性卒中后快速血流補充的影響
柔腦膜側支狀態是卒中結果的獨立預測因子。美國和日本的研究人員Atsushi Kanoke等通過光學相干斷層掃描血管造影術比較兩種固有柔腦膜側支化程度不同的小鼠品系（C57BL/6和Balb/C），確定了缺血性卒中后，側支血流和下游血流動力學的時空動力學變化。在C57BL/6小鼠大腦動脈（MCA）閉塞后，立即檢測到了強勁的軟腦膜側支血流補充，并在7天內持續擴張。相比之下Balb/C小鼠中幾乎沒有觀察到側支補充，同時梗塞面積更大、功能更差。此外卒中后，網狀小動脈（PA）血流量減少了90%以上，Balb/C小鼠的血流量減少更大，恢復更少，毛細血管轉運時間的異質性也更長。因此皮質卒中后，固有軟腦膜側支的范圍會影響下游血流動力學，并對微血管床產生長期影響。
背景
Willis環（CW）和柔腦膜（leptomeningeal, LMA）血管網分別由初級和次級側支通路構成。LMA側支可能向大腦皮層表面提供雙向動脈血液，連接大腦前動脈（ACA）與大腦中動脈（MCA）、大腦中動脈（MCA）與大腦后動脈（PCA），并在較小程度上連接ACA與PCA。當Willis環下游的大腦動脈突然閉塞時，LMA側支來補充維持血液供應。大量證據表明，缺血性卒中后的LMA側支化對卒中結果預測起關鍵作用。因此在急性缺血性卒中患者的治療管理中，常通過神經影像技術評估側支血流狀態，該方案ESCAPE臨床證實過并已經成為可靠的決策評估方法。已知年齡、血管風險因素和遺傳都會影響側支的發育和動態反應，但尚未完全確認影響腦血管側支化的具體因素。
研究較充分的是遺傳對固有側支范圍的影響，已被用于預測MCA卒中后的梗塞體積，通過同源圖確定了Dce1（determinant of collateral extent 1）基因。將Dce1的等位基因導入Balb/C小鼠基因組中，使軟腦膜側支范圍較野生型減少了83%，并以等位基因劑量依賴的方式恢復了腦血流量（CBF），減少了大腦中動脈閉塞（MCAO）后的梗塞體積，證實了缺血區域中固有側支在決定腦血管灌注上的重要性。
盡管已知在急性缺血性卒中后，固有側支循環與腦損傷嚴重程度存在一定的聯系，但仍無法解釋LMA側支系統如何以暫時的方式補償腦血流，如何影響下游小血管中的血液供應。之前許多臨床前研究無法評估滋養動脈對缺血性區域的貢獻，因為沒有合適的方法，只能依靠評估整體血液灌注或驗尸檢查。本文假設LMA側支范圍減少以及先前存在的側支直徑變小會影響卒中后從軟腦膜血管到微血管床的血液灌注，使用光學相干斷層掃描血管造影術（OCTA）評估皮質腦血流動力學進行驗證。使用2個固有LMA分支不同的小鼠品系C57BL/6和Balb/C，確定缺血性卒中后LMA吻合周圍的時空動力學，描述并比較不同的側支血流對下游網狀小動脈和毛細血管血流的影響，以及對卒中結果的影響。
圖1 OCT系統及OMAG方法示意圖。（a）1310 nm SD-OCT系統。SLD：超發光二極管；PC：偏振控制器。（b）OMAG掃描方案。一個cluster中進行8個連續掃描，應用OMAG算法提取血流信息。（c）3D OMAG體積式en face MIP。（d）DOMAG算法獲得速度B-frame。（e）從DOMAG數據產生的雙向軸向速度圖。顏色棒代表紅細胞的軸向速度，流量下降為陰性呈綠色，流量上升為陽性呈紅色。（f）皮質中下降的PA血流（頂部）和上升的小靜脈流（底部）。（g）x-y平面的PA和小靜脈血流信號。
結果
01-固有柔腦膜側支循環是卒中后快速逆向血流募集的原因
02-Balb/C小鼠中，卒中引起的大腦中動脈區網狀小動脈進一步加劇
使用DOCT確定逆行性軟腦膜側支血流如何影響下游網狀小動脈（PA）中的血流，獲得的en face流速圖譜顯示在圖4a中。可見MCAO后30min，C57BL/6和BALB/C小鼠中MCA區域的總PA流量顯著減少到約基線的13.7%和0.03%（圖4a，b），與之前研究結論一致，即PA是大腦皮層循環的瓶頸。C57BL/6小鼠MCA區域的PA在dMCAO后7天內逐漸恢復到基線流量的49.3%，而同期間內Balb/C小鼠僅恢復到6.7%（圖4b）。品系間總流量的差異體現在dMCAO期間PA的平均截面直徑上（圖4c）。兩個品系在dMCAO期間的ACA區域檢測到總血流減少，隨后7天恢復，C57BL/6和Balb/C分別恢復到基線的72 %和64%（圖4e）。dMCAO期間及后7天，C57BL/6小鼠中MCA區域PA的最大流速顯著大于Balb/C小鼠（圖4d），而dMCAO期間ACA區域該趨勢相反（圖4g）。
圖4 卒中后Balb/C小鼠大腦中動脈區PA血流幾乎耗盡，也幾乎沒有恢復。（a）在C57BL/6和Balb/C小鼠皮質表面下300 μm厚的組織板內，OMAG數據（上）和雙向DOMAG數據（下）。（b-d）每個品系MCA中總流量、平均截面面積和最大軸向流速的動態變化。（e–g）ACA中的動態變化。
03-與C57BL/6小鼠相比，Balb/C小鼠在卒中后的毛細血管轉運時間上表現出更大的異質性
評估并比較了不同品系間dMCAO后毛細血管轉運時間的平均及空間分布。掩蔽直徑大于15 μm的血管后，OCTA測速獲得的毛細血管的平均頻率（MF）圖顯示出來（圖5a）。從這些MF信號中推導出MCA和ACA區轉運時間的空間分布特征，包括平均毛細血管轉移時間（CTT）和毛細血管轉運時間異質性（CTTH）（圖2c）。Balb/C小鼠dMCAO后30 min平均CTT增加，并在MAC區域CCAO逆轉后持續了1h，但在ACA區域dMCAO期間及后1天都保持增加（圖5b，d），品系間無顯著差異。Balb/C小鼠中，卒中誘導的CTTH增加持續存在，而且MCA區域的增加在dMCAO期間較C57BL/6更顯著（圖5c，e），導致微血管阻力增加，卒中后氧攝取減少。Balb/C小鼠ACA區域的CTTH在dMCAO后也增加，但隨后7天內恢復。不同品系在ACA區域的CTTH上無顯著差異（圖5e）。 
圖5 卒中后，Balb/C小鼠毛細血管轉運時間表現出更強的空間異質性。（a）皮質板中毛細血管平局頻率圖。Balb/C小鼠卒中后，CTT顯著增加并持續到CCAO逆流以后，在（b）MCA和（d）ACA區域都是如此。卒中后CTTH增加，并在（c）MCA區域持續高著，或在（d）ACA區域中持續到dMCAO后1天。dMCAO期間Balb/C小鼠中CTTH增加較C57BL/6顯著更多。
04-C57BL/6和Balb/C小鼠在腦血管上的遺傳變異
為了確定缺血性卒中后固有LMA側支的范圍是否能幫助逆行血流補償，分析了DiI標記的動脈造影圖。基線時，C57BL/6小鼠ACA和MCA之間表現出明顯更多的相互連接的LMA吻合側支（圖6a，b），與以前的研究結果一致。相比之下，Balb/C小鼠的PcomA暢通性更好（圖6c）。兩品系中，ACA和MCA間從中線到邊界的距離在三個水平軸上都基本一致（圖6d），表明二者背側大腦半球中MCA相關區域類似，與以前的發現結果一致。
圖6 C57BL6和Balb/C小鼠MCAO之前固有柔腦膜側支的范圍對中結果的預測。（a）C57BL/6和Balb/C小鼠動脈造影圖。放大的黃色小圖顯示C57BL6小鼠MCA和ACA血管網之間有許多吻合點，但Balb/C小鼠沒有。（b）基線時MCA和ACA間連接側枝的量化。（c）對兩品系的PcomA暢通性進行評分和比較。（d）在三個不同的神經軸上測定ACA與MCA間中線到吻合線的距離。（e）與C57BL/6小鼠相比，Balb/C小鼠在卒中后7天的卒中尺寸明顯更大。（f）與卒中后7天的C57BL/6小鼠相比，Balb/C小鼠在（f）高架水平梯測試時滑落更頻繁，并且在（g）轉角測試中同側轉彎出現也顯著更多，反映了Balb/C小鼠在感覺運動不對稱方面更明顯的功能損傷。
05-柔腦膜血流的快速招募使梗塞體積和神經損傷較小
dMCAO后7天用云梯和轉角測試評估，發現與Balb/C小鼠相比，在C57BL/6小鼠中LMA血流的快速招募預示著較好的卒中結果，梗塞尺寸減小（圖6e-g）。雖然Balb/C小鼠的血流量和rCBF有所改善，但后期的血流招募并不能挽救已經缺血的腦組織，也不能改善卒中后的功能性結果。
結論
本研究通過比較兩種具有不同側支程度的小鼠，證明了固有LMA側支化對快速的側支血流動力學性有很大的影響。但由于急性缺血性卒中患者的側支狀態取決于側支血管的重塑，目前的研究可能無法確定人體內固有側支形成是否能單獨預測卒中結果。但有證據表明LMA的發展程度是動態的，運動和治療都能起到一定的促進作用。先前的研究結果也證明強調了LMA側支重構在決定卒中預后中的關鍵作用。最后，雖然側支循環的程度或狀態與缺血性損傷之間存在無可爭議的關系，但缺血性損傷的生物反應比較復雜，單獨的血管生成可能在治療或預治療缺血性卒中作用甚微，仍需要進一步研究探索。
背景
Willis環（CW）和柔腦膜（leptomeningeal, LMA）血管網分別由初級和次級側支通路構成。LMA側支可能向大腦皮層表面提供雙向動脈血液，連接大腦前動脈（ACA）與大腦中動脈（MCA）、大腦中動脈（MCA）與大腦后動脈（PCA），并在較小程度上連接ACA與PCA。當Willis環下游的大腦動脈突然閉塞時，LMA側支來補充維持血液供應。大量證據表明，缺血性卒中后的LMA側支化對卒中結果預測起關鍵作用。因此在急性缺血性卒中患者的治療管理中，常通過神經影像技術評估側支血流狀態，該方案ESCAPE臨床證實過并已經成為可靠的決策評估方法。已知年齡、血管風險因素和遺傳都會影響側支的發育和動態反應，但尚未完全確認影響腦血管側支化的具體因素。
研究較充分的是遺傳對固有側支范圍的影響，已被用于預測MCA卒中后的梗塞體積，通過同源圖確定了Dce1（determinant of collateral extent 1）基因。將Dce1的等位基因導入Balb/C小鼠基因組中，使軟腦膜側支范圍較野生型減少了83%，并以等位基因劑量依賴的方式恢復了腦血流量（CBF），減少了大腦中動脈閉塞（MCAO）后的梗塞體積，證實了缺血區域中固有側支在決定腦血管灌注上的重要性。
盡管已知在急性缺血性卒中后，固有側支循環與腦損傷嚴重程度存在一定的聯系，但仍無法解釋LMA側支系統如何以暫時的方式補償腦血流，如何影響下游小血管中的血液供應。之前許多臨床前研究無法評估滋養動脈對缺血性區域的貢獻，因為沒有合適的方法，只能依靠評估整體血液灌注或驗尸檢查。本文假設LMA側支范圍減少以及先前存在的側支直徑變小會影響卒中后從軟腦膜血管到微血管床的血液灌注，使用光學相干斷層掃描血管造影術（OCTA）評估皮質腦血流動力學進行驗證。使用2個固有LMA分支不同的小鼠品系C57BL/6和Balb/C，確定缺血性卒中后LMA吻合周圍的時空動力學，描述并比較不同的側支血流對下游網狀小動脈和毛細血管血流的影響，以及對卒中結果的影響。
圖1 OCT系統及OMAG方法示意圖。（a）1310 nm SD-OCT系統。SLD：超發光二極管；PC：偏振控制器。（b）OMAG掃描方案。一個cluster中進行8個連續掃描，應用OMAG算法提取血流信息。（c）3D OMAG體積式en face MIP。（d）DOMAG算法獲得速度B-frame。（e）從DOMAG數據產生的雙向軸向速度圖。顏色棒代表紅細胞的軸向速度，流量下降為陰性呈綠色，流量上升為陽性呈紅色。（f）皮質中下降的PA血流（頂部）和上升的小靜脈流（底部）。（g）x-y平面的PA和小靜脈血流信號。
結果
01-固有柔腦膜側支循環是卒中后快速逆向血流募集的原因
為確定固有側支如何在空間和時間上影響逆行血流，使用wild field Doppler OCT（DOCT）成像并量化遠端大腦前動脈及大腦中動脈的血流。基線條件時，從近端（S3）到遠端（S1）MCA分支檢測流入速度梯度減少（圖3a-c），但血管直徑保持相對恒定（圖3d）。dMCAO 30min后，C57BL/6小鼠中觀察到強勁的MCA逆流和連接遠端MCA及ACA的側支吻合，但Balb/C小鼠中沒有（圖3b）。dMCAO期間，C57BL/6小鼠中大部分臨近ACA和MCA連接點的遠端MCA小動脈的流速（圖3a）顯著減緩到基線值的56%和31%，Balb/C小鼠更甚，達到基線值的0.2%和1.7%。此后，C57BL/6小鼠中MCA小動脈更近端的流速和流量逐漸恢復，dMCAO后7天恢復了2-3倍（圖3b、c和e）。相反，Balb/C小鼠中，直到dMCAO后7天，S1和S2中的流速、血管直徑和流速沒有顯著恢復（圖3c-e）。使用DOCT在遠端MCA小動脈中評估不同品系在LMA血流恢復上的差異，使用激光多普勒血流儀（LDF）評估MCA區域rCBF的差異（圖3F），并將二者相關聯，表明側支血流范圍能夠預測缺血區的整體血液灌注狀態。
02-Balb/C小鼠中，卒中引起的大腦中動脈區網狀小動脈進一步加劇
使用DOCT確定逆行性軟腦膜側支血流如何影響下游網狀小動脈（PA）中的血流，獲得的en face流速圖譜顯示在圖4a中。可見MCAO后30min，C57BL/6和BALB/C小鼠中MCA區域的總PA流量顯著減少到約基線的13.7%和0.03%（圖4a，b），與之前研究結論一致，即PA是大腦皮層循環的瓶頸。C57BL/6小鼠MCA區域的PA在dMCAO后7天內逐漸恢復到基線流量的49.3%，而同期間內Balb/C小鼠僅恢復到6.7%（圖4b）。品系間總流量的差異體現在dMCAO期間PA的平均截面直徑上（圖4c）。兩個品系在dMCAO期間的ACA區域檢測到總血流減少，隨后7天恢復，C57BL/6和Balb/C分別恢復到基線的72 %和64%（圖4e）。dMCAO期間及后7天，C57BL/6小鼠中MCA區域PA的最大流速顯著大于Balb/C小鼠（圖4d），而dMCAO期間ACA區域該趨勢相反（圖4g）。
03-與C57BL/6小鼠相比，Balb/C小鼠在卒中后的毛細血管轉運時間上表現出更大的異質性
評估并比較了不同品系間dMCAO后毛細血管轉運時間的平均及空間分布。掩蔽直徑大于15 μm的血管后，OCTA測速獲得的毛細血管的平均頻率（MF）圖顯示出來（圖5a）。從這些MF信號中推導出MCA和ACA區轉運時間的空間分布特征，包括平均毛細血管轉移時間（CTT）和毛細血管轉運時間異質性（CTTH）（圖2c）。Balb/C小鼠dMCAO后30 min平均CTT增加，并在MAC區域CCAO逆轉后持續了1h，但在ACA區域dMCAO期間及后1天都保持增加（圖5b，d），品系間無顯著差異。Balb/C小鼠中，卒中誘導的CTTH增加持續存在，而且MCA區域的增加在dMCAO期間較C57BL/6更顯著（圖5c，e），導致微血管阻力增加，卒中后氧攝取減少。Balb/C小鼠ACA區域的CTTH在dMCAO后也增加，但隨后7天內恢復。不同品系在ACA區域的CTTH上無顯著差異（圖5e）。
04-C57BL/6和Balb/C小鼠在腦血管上的遺傳變異
為了確定缺血性卒中后固有LMA側支的范圍是否能幫助逆行血流補償，分析了DiI標記的動脈造影圖。基線時，C57BL/6小鼠ACA和MCA之間表現出明顯更多的相互連接的LMA吻合側支（圖6a，b），與以前的研究結果一致。相比之下，Balb/C小鼠的PcomA暢通性更好（圖6c）。兩品系中，ACA和MCA間從中線到邊界的距離在三個水平軸上都基本一致（圖6d），表明二者背側大腦半球中MCA相關區域類似，與以前的發現結果一致。
05-柔腦膜血流的快速招募使梗塞體積和神經損傷較小
dMCAO后7天用云梯和轉角測試評估，發現與Balb/C小鼠相比，在C57BL/6小鼠中LMA血流的快速招募預示著較好的卒中結果，梗塞尺寸減小（圖6e-g）。雖然Balb/C小鼠的血流量和rCBF有所改善，但后期的血流招募并不能挽救已經缺血的腦組織，也不能改善卒中后的功能性結果。
結論
本研究通過比較兩種具有不同側支程度的小鼠，證明了固有LMA側支化對快速的側支血流動力學性有很大的影響。但由于急性缺血性卒中患者的側支狀態取決于側支血管的重塑，目前的研究可能無法確定人體內固有側支形成是否能單獨預測卒中結果。但有證據表明LMA的發展程度是動態的，運動和治療都能起到一定的促進作用。先前的研究結果也證明強調了LMA側支重構在決定卒中預后中的關鍵作用。最后，雖然側支循環的程度或狀態與缺血性損傷之間存在無可爭議的關系，但缺血性損傷的生物反應比較復雜，單獨的血管生成可能在治療或預治療缺血性卒中作用甚微，仍需要進一步研究探索。
參考文獻：Kanoke, Atsushi , et al. "The impact of native leptomeningeal collateralization on rapid blood flow recruitment following ischemic stroke." Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism (2020):0271678X2094126.
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