疫苗是醫學領域最偉大的進步之一，也是一種重要的疾病防治手段，在傳染病防控中發揮著重要作用。自1798年天花疫苗和1885年狂犬病疫苗以來，疫苗技術從使用滅活及減毒病原體發展到使用僅包含可觸發免疫反應的病原體成分的亞單位。常用的疫苗包括類病毒顆粒疫苗、重組病毒載體疫苗以及類毒素疫苗、多糖疫苗或蛋白疫苗。
 

 

傳統的減毒和滅活疫苗至今仍被廣泛使用（如卡介苗和脊髓灰質炎滅活疫苗等）。然而，由于使用全部病原體，它們存在較大的安全性風險，通常它們沒有明確的成分。就類毒素疫苗和亞單位疫苗而言，盡管它們具有較好的安全性和穩定性，但需要使用佐劑才能產生強烈的免疫反應，并且保護時間有限（表1）。因為沒有標準化的生產工藝，傳統上的疫苗研發通常是一個漫長、有挑戰性大且昂貴的過程。此外，SARS和埃博拉疫情以及新冠大流行表明，傳統的技術平臺并不適合快速、高效應對突發公共安全事件。病毒載體和DNA技術是兩個前沿技術平臺，具有開發快和生產工藝靈活性的特點。然而，病毒載體疫苗的生產成本高昂、成分復雜、保護率偏低且具有潛在的安全性風險，DNA疫苗的免疫原性差且存在基因整合安全性風險（表1），限制了其在臨床中的廣泛應用。

表1 各類疫苗的優點（＋）和缺點（×）

 

mRNA一些獨特的技術優勢，使其非常有希望成為傳統疫苗甚至DNA疫苗的替代品。與減毒或滅活疫苗不同，mRNA只表達特定抗原并定向誘導免疫反應。此外，它促進體液和細胞免疫反應，并誘導先天免疫系統。與DNA疫苗相比，mRNA更安全有效，因為表達不需要進入細胞核，隨機基因組整合的概率幾乎為零；此外，mRNA在細胞中會在較短時間內（2-3天）降解。mRNA疫苗編碼不同抗原不會影響mRNA主體結構的理化學性質，有利于采用標準化生產。由于mRNA生產是基于體外無細胞轉錄反應系統，因此無其他疫苗生產中常見的細胞來源雜質和病毒污染物等安全性風險。另外，mRNA疫苗開發周期短且具有廣譜性，自2020年1月中國科學家公布新冠病毒基因序列，到12月FDA批準BioNTech的BNT162b2的緊急使用權，僅僅間隔不到1年的時間。目前，mRNA疫苗正被研發用于多種傳染性疾病，例如HIV、狂犬病毒、流感、埃博拉、瘧原蟲和呼吸道合包病毒（RSV）等。

 

▉mRNA疫苗結構及工程化修飾

mRNA疫苗的結構類似于真核mRNA，一個單鏈分子在5“端有一個帽子結構（Cap），在3“端有一個Poly（A）尾，一個開放閱讀框（ORF）兩側有一個非翻譯區（UTR）。

圖2 mRNA疫苗結構

 

5“Cap是mRNA疫苗非常重要的結構，它與真核生物翻譯起始因子（eIF4E）結合來啟動翻譯，另外5“Cap使其免于核酸外切酶的降解，還可促使mRNA環化形成空間及結構，增強穩定性。甲基化程度不同可形成3種類型的帽子：CAP 0型、Cap 1型和Cap 2型。3’UTR尾部是一段Poly A序列，與帽子結構類似，Poly（A）尾也能起到保護mRNA防止被核酸外切酶降解的作用，Poly A也參與到翻譯及其調控過程中，可與多聚腺苷酸結合蛋白（PABP）結合形成環狀復合物，參與翻譯的起始過程。非翻譯區（UTR）影響轉錄調控和mRNA穩定性，這些區域強烈影響翻譯效率。調節先天免疫反應的策略，如引入非天然核苷（NTPs），以及通過密碼子優化提高翻譯效率，也常用于mRNA疫苗。輝瑞/BioNTech的mRNA疫苗BNT162b2和Moderna的mRNA-1273利用了核苷修飾技術，用假尿苷替換尿苷。而CureVac的mRNA疫苗CVnCoV使用未經修飾的天然mRNA，通過其RNActive 平臺改變mRNA序列并優化密碼子，以提高mRNA的穩定性和免疫原性。

 

5“Cap、Poly A尾巴及編碼序列兩側的5ʹ和3ʹUTR元件深刻影響mRNA的穩定性和翻譯，這些都是疫苗的關鍵問題。通過工程化改造mRNA疫苗可大大增加其穩定性及免疫效力。

圖3 疫苗工程化修飾改造

 

▉mRNA生產及展望

與傳統疫苗相比，mRNA最重要的優勢之一是其相對簡單的制造。mRNA疫苗生產可分為上游加工（包括酶促反應生成初級mRNA）和下游加工（包括純化mRNA）（圖4）。

圖4 mRNA生產工藝

 

▉上游工藝

轉錄：上游主要是以質粒為模板在T7、SP6或T3 RNA聚合酶的作用下轉錄成初級mRNA，該反應只需要幾個小時，通常，每毫升反應可獲得毫克級的初始mRNA。

 

加帽：初始mRNA加帽，可以在轉錄反應期間通過使用Cap類似物替代三磷酸鳥苷（GTP）底物來實現。或者，可以使用牛痘加帽酶（VCC）和甲基供體作為底物在第二次酶反應來加帽（圖4）。相比使用Cap類似物加帽（60–80%），盡管第二種方法的加帽效率更高（可達100%），但使用cap類似物加帽工藝更快，不需要二步酶促反應。然而，由于價格的原因，Cap類似物可能會對生產成本產生影響，特別是在大規模制造的情況下考慮。

 

▉下游工藝

上游產生的mRNA需通過多個純化步驟從反應混合物中分離和純化，以達到臨床質量要求（圖4）。反應混合物不僅包含所需mRNA，還包含許多雜質，如酶、殘余NTP和DNA模板，以及轉錄期間形成的異常mRNA（如ds mRNA）。

 

色譜是制藥行業廣泛使用的一種純化方法，離子交換色譜法（IEC）可用于大規模純化mRNA，弱陰離子交換色譜法已成功用于mRNA的純化。然而，這種色譜必須在變性條件下進行，使得該工藝需嚴格控制溫度。

 

Olig dT親和色譜可與mRNA中存在的poly-A尾部結合，常用于捕獲mRNA并獲得高純度產品，且可規模化純化生產，但存在結合能力低和低成效的缺點。

 

切向流過濾（TFF）濃縮可以去除小分子雜質，這依賴于DNA酶消化去除質粒模板，質粒模板去除也可以通過羥基磷灰石法或疏水色譜法（HIC）實現。

 

▉未來方向

目前生產工藝（如體外轉錄工藝）難以滿足未來大規模商業化需求，連續流生產模式是未來的發展方向，具有低成本的獨特優勢。連續流生產模式已經在化學和制藥行業中使用，具有靈活且經濟高效的特點。此外，連續流生產模式實現工藝的集成化還可以縮短生產時間，促進自動化和過程分析技術（PAT），從而提高生產率和產品質量。mRNA制造工藝的相對簡單性使得該過程非常適合于連續流生產模式，尤其是在微流控模式下（圖5）。在這種規模下，在特定條件下可以加快反應速度，可以最大限度地降低昂貴試劑（如牛痘加帽酶、甲基轉移酶等）的成本。此外，即時基質進料和產品收獲策略可以在流程中實施，以促進過程控制、再循環和物料的再利用。

圖5 mRNA連續流生產模式

 

▉mRNA商業化生產挑戰

在mRNA生產過程中作為起始模板使用的質粒產能及質量的非常關鍵因素，也是制約mRNA疫苗生產的瓶頸。mRNA生產需要以質粒DNA為模板轉錄成初始mRNA，環狀質粒需酶切線性化，線性化效率對工藝生產有較大影響；另外，質粒模板中的Olig dT的長度決定mRNA疫苗Poly A的長度，Poly A長度影響mRNA的穩定性及翻譯效率，因而影響mRNA疫苗的有效性。另外，mRNA疫苗需要控制Poly A長度及體外翻譯效率在一定范圍，Poly A長度的分析方法及體外翻譯效率檢測方法也是mRNA疫苗質量研究的難點，非常具有挑戰性。Poly A長度及外翻譯效率取決于質粒模板中的Olig dT的長度，質粒模板中的Olig dT常隨大腸桿菌傳代而丟失，因此在源頭上控制質粒模板的質量對mRNA疫苗的效果非常重要。

 

質粒作為mRNA生產的關鍵原材料，需要在良好生產規范（cGMP）條件下，且需要有穩健的工藝，在臨床試驗審批（Investigational New Drug，簡稱IND）申報時需要提供藥學研究資料，包括主細胞庫和工作細胞庫、質粒DNA生產工藝等，在制備用于產生質粒DNA的工程菌庫時，也需遵循cGMP實踐的原則并參照指南進行相應的檢測。

 

來源：醫藥速覽

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參考出處：

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