近日，真邁生物在BMC bioinformatics上發表了題為“Systematic and benchmarking studies of pipelines for mammal WGBS data in the novel NGS platform”的研究成果。該研究在真邁生物GenoLab M高通量測序平臺和Illumina的NovaSeq 6000平臺進行全基因組甲基化測序，比較了兩個平臺對小鼠肝臟細胞系NCTC1469和人胚胎腎細胞系293（HEK293）的全基因組甲基化圖譜的差異與影響，并探究了GenoLab M平臺對于目前5款常用甲基化分析流程（BSMAP，Bismark，BS Seeker2，BatMeth2，BSBolt）的偏好性。
 
背景介紹
全基因組甲基化測序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）主要是通過重亞硫酸鹽將基因組序列中沒有發生甲基化的胞嘧啶（Cytosine--C）轉化為尿嘧啶，再通過高通量測序平臺，對胞嘧啶的甲基化水平進行檢測，精確解析每一個胞嘧啶（C）的甲基化狀態，從而構建全基因組甲基化圖譜，深入探究甲基化胞嘧啶在人類疾病、生長發育過程中的重要作用。
 
結果概要
1.項目研究概要
本研究采用小鼠肝臟細胞系和人胚胎腎細胞系樣本，各有2個生物學重復，構建完甲基化文庫后，文庫一分為二，分別在GenoLab M平臺和NovaSeq 6000平臺測序，共獲得8個下機數據。隨后完成全基因組甲基化分析，解析不同平臺的甲基化圖譜分布的影響和差異，以及GenoLab M平臺數據的分析軟件偏好。  
2.數據質控-GenoLab M平臺數據質量更好
兩個平臺下機序列（reads）開頭和結尾的幾個堿基質量較低，這會影響后續序列在全基因組上的比對準確性。因此，我們比較了截取不同長度堿基后序列的比對情況。發現，將read1序列的結尾和read2序列的開頭分別截取掉10個堿基，可以有效提升全基因組范圍內的唯一比對準確率，參見圖2 a和c圖。基于上述處理后，我們發現，同等下機數據情況下，GenoLab M平臺的有效數據產出更多。  
3.甲基轉化率平臺間差異表現和分析軟件偏好類似
隨后，我們分別使用了五個常用的分析軟件進行全基因組的比對分析和甲基化C分布檢測的平行比較。結果發現，GenoLab M平臺數據的重復序列相對NovaSeq 6000更低（人3.05% VS 12.38%，鼠2.82% VS 17.24%）。兩個測序平臺的數據使用BSBolt軟件均可獲得最高的唯一比對率（人94%，小鼠91%）；其次是BetMath2軟件（人91%，小鼠86%）。兩個測序平臺產出數據使用BS Seeker2比對獲取到的唯一比對率最低。五個軟件檢測到的甲基化C占比均為70~80%范圍內。  
4.全基因組甲基化圖譜一致性評估
使用五個軟件對兩個平臺產出的數據進行分析，我們發現，所有軟件獲取的全基因組范圍內CG序列甲基化率分布圖譜（mCGs）均具有較高的一致性，但是CHG和CHH序列甲基化率分布圖譜差異較大。通過檢測不同生物學重復樣本所有的甲基化C位點（mCs）和CG序列甲基化的C位點（mCGs），我們發現，相對于NovaSeq 6000平臺，GenoLab M平臺數據具有更多的mCs和mCGs位點，且在不同生物學重復樣本中，這些mCs和mCGs具有更高的一致性。
 
比較五個分析軟件所能檢測到的全基因組C，我們發現，在生物學重復樣本中，BSMAP、BS Seeker2和Bismark獲取到的mCGs的結果一致性更高，且結果可以相互驗證。綜合比較，BSMAP軟件獲取的結果相對來說最好，且耗時也相對最少。
   
   
5.mCGs圖譜與早期分析的mCGs圖譜的比較
基于BSMAP軟件獲取的全基因組甲基化圖譜在基因附近的分布分析，我們發現，不管是在人細胞系中，還是在小鼠細胞系中，兩個平臺的結果一致性均較高。通過與早期已發表的HEK293細胞系的全基因組甲基化圖譜結果比較，并重點關注了兩個基因（GNB1和NSUN2）中甲基化位點的分布情況，我們發現兩個平臺數據集和早期的三個數據集中這兩個基因的甲基化圖譜一致性均較高。  
 結論
基于上述全面的分析，我們得出如下結論：
1 、GenoLab M與NovaSeq 6000兩個平臺產出的甲基化數據通過有效截斷過濾，可顯著提升序列比對準確性；
2 、GenoLab M平臺測序數據的重復序列更低，有效序列更多；
3、 GenoLab M平臺數據包含更多有效的mCs和mCGs位點，且在人和鼠生物學重復樣本中，其結果一致性更高；
4 、五個常用甲基化分析軟件中，BSMAP的結果最好，相對耗時更短。
 
 討論
甲基化測序技術作為研究生命過程中基因調控的重要工具，在細胞分化和疾病進展方面得到了廣泛的應用，臨床檢測方面的應用也越來越多。例如：腫瘤早篩-進展監測、精準治療選擇、微小殘留監測、預后-復發檢測等。目前，有研究發現，含有游離核酸的體液樣本中可能含有腫瘤特異的DNA甲基化信號，它們可能是潛在的生物標志物。GenoLab M平臺在本次WGBS全面分析中表現出測序質量更穩定、更高，數據覆蓋度更深，重復率更低，甲基化一致性水平更高，準確率更好等性能，能滿足更多的甲基化測序項目需求。