近日，真邁生物的合作單位湖北省疾病預防控制中心在《Frontiers in Microbiology》雜志上發表了題為“Genetic characterization of human adenoviruses in patients using metagenomic next-generation sequencing in Hubei, China, from 2018 to 2019”的研究成果。該研究基于真邁生物GenoLab M高通量基因測序平臺與Illumina的NextSeq 550高通量基因測序平臺，對湖北省某兒童醫院25例上呼吸道感染患者的鼻咽拭子樣本進行mNGS測序。基于測序的分析結果，探討了病原基因組組裝的準確性，以及兩個平臺在病原微生物mNGS檢測方面的一致性，隨后，對完整組裝的HAdVs基因組特征進行了全方位的剖析，為中國HAdVs流行病學調查及公共衛生安全提供新的見解。
 
*以下為該研究成果解讀

背景簡介
腺病毒（Human adenoviruses，HAdVs) 是人呼吸道感染常見的病原體之一，可引起廣泛的臨床疾病，包括肺炎、支氣管炎、膀胱炎、眼結膜炎、胃腸道疾病及腦炎等，在兒童及免疫功能缺陷患者中癥狀尤其嚴重。HAdVs基因型別眾多，且不同型別間或同一型別內均可發生重組，導致新的毒株產生，對公共衛生安全產生極大的影響。傳統對HAdVs的診斷及分型主要依賴病毒分離培養、血清學及關鍵衣殼蛋白（capsid）基因的PCR鑒定，費時費力，且對中和抗體等試劑依賴程度很高。基于mNGS的病原微生物診斷，可以直接對臨床樣本中的核酸進行高通量測序，而不依賴微生物的分離和培養，能夠快速、客觀地檢測臨床樣本中所有未知的病原微生物，已成為感染性疾病精準診斷的重要工具。此外，通過對mNGS序列進行病原體基因組組裝，可以在基因組和基因層面對病原體進行深入的探究。

結果概要
1.研究框架
本研究于2018~2019年，在湖北省咸寧市某醫院收集400例流感樣上呼吸道感染患者的鼻咽拭子樣本，對常見呼吸道病毒病原體進行篩查后，確定21例HAdVs陽性患者，共獲得25份樣本（包含4例病毒分離培養樣本）。隨后，將這25個樣本分別使用GenoLab M及NextSeq 550平臺進行宏基因組測序和相關分析。
 
2.mNGS組裝完整性及準確性評估
本研究首先對所有下機數據進行測序質量評估，確定GenoLab M及NextSeq 550平臺均可獲得可靠的mNGS測序數據。隨后對測序reads進行de novo組裝，并評估了組裝的完整度及準確性。結果表明：①在組裝完整性方面（指標：contig數量, N50, N90, 最大contig長度，覆蓋度），兩平臺基本一致；②在組裝準確性方面（指標：組裝的基因組與參考基因組的比對率），GenoLab M平臺88% (22/25)的樣本，NextSeq 550平臺84% (21/25)的樣本，獲得了＞90%的比對率。說明兩平臺組裝的基因組準確性均較高，可以進行后續基因組特征的分析。  
3.平臺間mNGS物種注釋結果比較
研究人員對兩個平臺的mNGS數據進行了物種注釋，發現檢出的微生物種類及豐度高度一致，且HAdVs含量豐富。臨床樣本相對病毒分離培養的樣本，檢出的微生物種類更為復雜。SE75（圖1B）模擬測序與SE150（圖1A）測序獲得一致的物種注釋結果，說明在基于mNGS的HAdVs感染診斷中，測序時間更短的SE75模式同樣適用，可以實現更快速的病原體診斷。  
4.HAdVs基因型分類及進化樹分析
該研究對25個測序樣本進行了HAdVs分型，共鑒定得到7種HAdVs基因型：HAdV-B3 (n=9)，B7 (n=1)，B55 (n=2)；HAdV-C1 (n=2)，C2 (n=6)，C5 (n=1)；以及HAdV-E4 (n=4)。結果表明，在湖北咸寧地區，HAdV基因型多樣性較高，且以B3, C2和E4為主。不同的基因型聚類為不同的進化分支，同一基因型的不同分離株聚類為同一分支。  
5.不同基因型的全基因組進化樹分析
為進一步探討不同型別的分離株與已發現的參考毒株的進化關系，研究人員對HAdV-B，C，E毒株分別進行了全基因組進化分析。結果表明：①新鑒定的分離株與對應的參考毒株形成預期的聚類，且與當地廣泛流傳的毒株進化關系密切；②B3基因型已開始形成新的聚類分支，需加強流行病學監測；③S64、S71和S28分離株經重組及全基因組比對分析，確定為重組毒株。  
6.核苷酸一致性和多樣性分析
全基因組核苷酸一致性分析表明，HAdVs不同型別間具有較高的進化保守性，HAdV-B, C和E基因組一致性分別達到93.52%，97.49%和96.99%。三個關鍵capsid基因——penton，hexon和fiber的多樣性分析表明：penton基因在HAdV-C中更為保守，在HAdV-B中多樣性很高，且存在兩個明顯的高變區；hexon基因在HAdV-B和C中多樣性更高，同樣存在兩個高變區，形成中和抗體識別的表位；fiber基因在三種基因型中，多樣性都很高，其C端的γ表位參與血凝抑制，決定病毒的組織偏好性（嗜性）。  

結論
基于上述分析，我們得出如下結論：
1、mNGS可以應用于臨床樣本HAdVs的快速診斷；
2、通過de novo組裝可以得到完整的病毒基因組，其準確性及完整度滿足后續基因層面的分析要求；
3、新鑒定的HAdV-B3分離株形成明顯的新聚類，且與北京株親緣關系密切，提示區域傳播的可能；
4、本次檢測到3個HAdV重組病毒株，屬于HAdV-B55及HAdV-C2基因型；
5、Capsid基因存在高核苷酸多樣性和高頻的重組事件，提示在中國進行HAdV流行病學監測的必要性。
 
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