PCR反應擴增需要注意事項總結
PCR是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction）的簡稱，是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術。以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物原料，在引物引導的情況下，模板與底物通過DNA聚合酶的聚合延伸，多次重復后使DNA呈指數擴增復制。PCR反應擴增需要注意事項如下：
1. 引物的質量是保證PCR特異性的關鍵，引物過長或過短均會使特異性降低，以18～30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內部和引物之間不應含有互補序列；引物的堿基順序與非擴增區域的同源性應小于70%；引物的3’末端與模板DNA一定要配對，但末端沒有嚴格的限制，故引物設計時可在5’末端加上限制性內切酶位點和/或啟動密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產物中的不完整序列、脫嘌呤產物、堿基修飾鏈等“雜質”；引物的終濃度一般為0.2～0.5μmol/L，過低會影響反應產量，過高會增加引物二聚或錯配的幾率。
2. Taq DNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但無3’-5’外切酶活性，因此對單核苷酸的錯配無校正功能，發生堿基錯配的幾率為 2.1×10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優勢在于反應產量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經基因工程改造后，新創出的Pfu Ultra具有更佳的校驗活力。數據顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶(保真度＝1/錯誤率) (數據來源：美國冷泉港實驗室)。
3. Mg2+濃度也是影響反應效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結合，不同反應體系中應適當調整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5～1.0mmol/L為宜，Mg2+過量能增加非特異擴增。
4. dNTP的濃度過高會增加堿基的錯誤摻入率，使反應特異性下降；過低則會導致反應速度下降。使用時4種dNTP必須以等當量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯配誤差和提高使用效率。
5. 溫度循環參數中應特別注意復性溫度，它決定引物與模板的特異性結合。退火復性溫度可根據引物的長度，通過Tm＝4(G+C)+2(A+T) 計算得到。在Tm允許的范圍內，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結合。
6. 減低污染的常規措施：
①將PCR試劑、PCR產物及其他分子生物學試劑分開放置；
②應保持樣品制備、PCR反應液配制與PCR產物分析三個工作區的獨立性；
③使用陽性和陰性對照；
④使用最高質量的水配制PCR實驗的所有反應試劑；
⑤配制好的PCR反應試劑應分成小包裝儲存，每個包裝僅用于單次實驗；
⑥制備樣品、配制試劑及反應液時必須戴手套；
⑦實驗前一定要認真清潔加樣器等。
1. 引物的質量是保證PCR特異性的關鍵，引物過長或過短均會使特異性降低，以18～30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內部和引物之間不應含有互補序列；引物的堿基順序與非擴增區域的同源性應小于70%；引物的3’末端與模板DNA一定要配對，但末端沒有嚴格的限制，故引物設計時可在5’末端加上限制性內切酶位點和/或啟動密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產物中的不完整序列、脫嘌呤產物、堿基修飾鏈等“雜質”；引物的終濃度一般為0.2～0.5μmol/L，過低會影響反應產量，過高會增加引物二聚或錯配的幾率。
2. Taq DNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但無3’-5’外切酶活性，因此對單核苷酸的錯配無校正功能，發生堿基錯配的幾率為 2.1×10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優勢在于反應產量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經基因工程改造后，新創出的Pfu Ultra具有更佳的校驗活力。數據顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶(保真度＝1/錯誤率) (數據來源：美國冷泉港實驗室)。
3. Mg2+濃度也是影響反應效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結合，不同反應體系中應適當調整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5～1.0mmol/L為宜，Mg2+過量能增加非特異擴增。
4. dNTP的濃度過高會增加堿基的錯誤摻入率，使反應特異性下降；過低則會導致反應速度下降。使用時4種dNTP必須以等當量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯配誤差和提高使用效率。
5. 溫度循環參數中應特別注意復性溫度，它決定引物與模板的特異性結合。退火復性溫度可根據引物的長度，通過Tm＝4(G+C)+2(A+T) 計算得到。在Tm允許的范圍內，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結合。
6. 減低污染的常規措施：
①將PCR試劑、PCR產物及其他分子生物學試劑分開放置；
②應保持樣品制備、PCR反應液配制與PCR產物分析三個工作區的獨立性；
③使用陽性和陰性對照；
④使用最高質量的水配制PCR實驗的所有反應試劑；
⑤配制好的PCR反應試劑應分成小包裝儲存，每個包裝僅用于單次實驗；
⑥制備樣品、配制試劑及反應液時必須戴手套；
⑦實驗前一定要認真清潔加樣器等。
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