文獻信息
同濟大學醫學院施劍林院士團隊及其附屬上海市第十人民醫院骨科等團隊的研究成果Hydrolysis of 2D Nanosheets Reverses Rheumatoid Arthritis Through Anti-Inflammation and Osteogenesis (2D納米片原位水解通過抗炎和成骨治療類風濕性關節炎) 在學術期刊《ADVANCED MATERIALS》 (IF：27.4) 上發表。平生公司的離活一體CT (NEMO) 在論文中提供了重要的小鼠踝關節、兔子膝關節圖像和定量分析結果。

該論文的通訊作者為同濟大學醫學院霍敏鋒研究員和吳鵬副教授，第一作者為同濟大學醫學院冀鵬豪博士生。

文獻摘要
類風濕性關節炎(RA)是一種關節功能障礙的炎癥疾病。臨床上，針對RA的藥物僅側重于減輕局灶性炎癥，而不考慮骨微環境的促成骨重建。在本研究中，通過簡單的液相剝離制備了二維層狀二硅化鈣納米片(CSNs)。CSNs的水解產生抗氧化H₂、堿性Ca(OH)₂和二氧化硅。這些部分在抗氧化、抗炎和促骨生成中起著重要作用，導致比單獨抗炎更好的RA治療效果。氫氣被證實可以消除過量的羥基自由基并調節巨噬細胞的再極化；生成的Ca(OH)₂可以中和酸性微環境并抑制破骨細胞活性；而且，溶解的Ca²⁺可以有效地與磷酸鹽復合，礦化成Ca₃(PO₄)₂，促進病灶關節的成骨。

實驗方法
佐劑誘導的關節炎（AIA）小鼠和兔模型
20只雌性Balb/c小鼠（6周齡）隨機分為四組（N=5）。第一組被選為對照組，不進行任何治療。另一組在小鼠右后踝關節注射25μL CFA，建立AIA模型。同時，左后踝關節注射相同體積的PBS。每三天用游標卡尺記錄踝關節的寬度。計算右關節與左關節的寬度比，以評估關節腫脹程度。

 為了建立AIA兔模型，將20只兔子隨機分為四組（N=5）。第一組被選為對照組，不進行任何治療。其他組通過反復注射卵清蛋白（OVA）和CFA進行免疫接種。簡而言之，將OVA溶解在PBS（20 mg mL^-1）中，并與等體積的CFA混合。然后在4°C下將混合物完全乳化。每周在背部皮下的五個部位注射1mL乳液對兔子進行免疫接種，持續3周。在第三周和第四周，將混合的OVA/CFA乳液注射到雙側膝關節中（每膝0.5mL），以誘導AIA兔模型。
 AIA小鼠關節炎治療的體內評估：三組AIA小鼠（N=5）分別關節內注射25μL PBS或等體積含CSNs（3 mg kg⁻¹）或DMP（10 mg kg⁻¹）的PBS。每3天測量一次體重和踝關節寬度。評估3周后，處死所有小鼠并收集踝關節組織。通過RT-PCR分析評估促炎細胞因子（TNF-α和IL-6）和抗炎細胞因子（CD206和IL-10）的水平，并通過顯微CT（平生醫療科技有限公司）掃描評估組織形態計量學。還量化了關節的組織形態計量學參數（Tb.Sp和Tb.BMD）。
 

AIA兔關節炎治療的體內評估：三組AIA兔（N=5）分別關節內注射500μL PBS或等體積含CSNs（3mg kg⁻¹）或DMP（10mg kg^−L）的PBS。每三天測量一次體重和踝關節寬度。1周內兩次給藥后，通過MRI記錄膝關節的病理過程。評估期結束后，處死關節炎兔和正常兔，收集膝關節組織。通過ELISA評估促炎細胞因子（TNF-α和IL-6）和抗炎細胞因子（IL-10）的蛋白質水平。通過顯微CT（平生醫療科技有限公司）掃描評估組織形態計量學，并量化關節的組織形態計量參數（Tb、Sp和Tb、BMD）。

實驗結果
采用佐劑誘導性關節炎（AIA）方法建立RA小鼠模型。具體來說，雌性Balb/c小鼠在右后踝關節內注射完全弗氏佐劑（CFA），然后免疫5天，導致關節明顯腫脹（圖6a；）。將15只關節炎小鼠隨機分為三組（N=5），關節內注射PBS或等體積的含CSN或地塞米松磷酸鈉（DMP，臨床批準的藥物）的PBS。另取5只未注射佐劑的健康小鼠作為對照組。DMP治療組的小鼠體重略有下降，而其他組的小鼠在評估期的27天內體重沒有明顯波動，這可能是由于DMP的副作用造成的（圖6c）。在對照組和DMP治療組的小鼠中觀察到可忽略或中等的治療效果。CSNs組踝關節腫脹明顯減輕（圖6b）。在治療終點拍攝的照片清楚地顯示，與對照組和DMP組相比，CSNs組的踝關節腫脹明顯減輕，與聯合測量結果一致（圖6d）。顯微CT掃描圖像顯示，與正常組相比，關節炎組小鼠的踝關節有明顯的骨侵蝕。CSNs和DMP均顯著改善了骨侵蝕，驗證了CSNs的高療效（圖6e）。基于顯微CT分析的骨微觀結構的組織形態計量學參數，如小梁骨礦物質密度（Tb.BMD）和小梁間距（Tb.Sp），表明CSN治療后RA關節的骨顯微結構與健康關節相似，這歸因于CSN的強大抗炎和促生物礦化作用（圖6f，g）。

圖6. CSNs對AIA小鼠抗RA療效的評價。a） 小鼠AIA模型建立和治療方案的示意圖。b） c）受不同治療的小鼠的體重曲線。數據表示為平均值±標準差（N=5）。d） 不同組別小鼠踝關節的代表性照片。e） 在第27天，來自不同組的小鼠右踝關節的代表性3D重建顯微CT圖像。第27天不同組小鼠右踝關節骨微觀結構的組織形態學顯微CT分析[f）Tb.BMD和g）Tb.Sp]。數據表示為平均值±標準差（N=4）。h） mRNA（IL-6、IL-10、TNF-α、TNF-α）的相對表達，CD206）。數據表示為平均值±標準差（N=4）。i） 不同組別小鼠右踝關節的代表性H&E染色、賽峰紅固定綠染色、ALP和TRAP染色圖像。

顯微CT分析的結果提供了股骨脛骨軟骨下骨結構的信息（圖7e）。從不同角度（如冠狀面、正中矢狀面和橫斷面）對膝關節進行計算重建，清楚地表明RA組兔子的股骨脛骨軟骨下骨受到侵蝕。CSN治療通過抗炎和釋放生物礦化物質（無定形磷酸鈣和二氧化硅）逆轉了兔子的RA進展。DMP對家兔的抗炎治療和RA逆轉作用效果有限。股骨脛骨軟骨下骨微觀結構的組織形態計量學參數，如Tb.BMD和Tb.Sp用于定量分析RA關節的骨微觀結構（圖7f，g）。與顯微CT重建圖像一致，由于CSN具有強大的抗炎和探針礦化作用，CSN治療后的骨參數與健康關節的骨參數相似。

圖7.CSNs對AIA兔抗RA療效的評價。a）兔AIA模型建立和治療方案示意圖。b）不同組別家兔膝關節周長的時間依賴性。數據表示為平均值±標準差（N=5）。c） 紅外熱成像圖像和d）不同組別兔子膝關節的焦點溫度。數據表示為平均值±標準差（N=5）。e）在第70天，不同組別兔子膝關節的代表性3D重建顯微CT圖像。不同組別兔膝關節骨微觀結構的組織形態計量顯微CT分析[f）Tb.BMD和g）Tb.Sp]。數據表示為平均值±標準差（N=3）。h）TNF-α，i） IL-6和j）在第70天從不同組的兔關節獲得的滑液的IL-10。數據表示為平均值±標準差（N=3）。

使用結論
總之，通過簡單的液相剝離方法成功合成了2D納米片CSN，通過其水解產物——抗氧化/抗炎H₂氣體和堿性Ca(OH)₂治療類風濕性關節炎，這些產物抑制破骨細胞活性，并通過CSN中的Ca²⁺溶解促進CAP礦化實現促成骨作用。制備的CSN尺寸為280nm，RA的酸性微環境會加速水解反應，水解產生的Ca²⁺原位礦化成CAP促進骨修復。CSNs的抗氧化、抗炎、促成骨和抗破骨的作用在體外得到驗證。從機制上講，病灶的巨噬細胞的復極化在CSNs治療RA中起著關鍵作用，這是通過納米材料產生的氫氣消耗過量ROS和恢復炎癥穩態來實現的，機制上來說，主要是抑制NF-κB和MAPK信號通路的過度激活來實現。在AIA小鼠和兔模型中，合成的CSNs在抗炎和骨礦化方面表現出優異的生物安全性和治療性能。作者的工作開發了一種精細的層狀CSNs納米藥物，不僅可以抑制炎癥，而且具備骨修復和軟骨恢復功能，為對抗類風濕性關節炎提供了基本的理解和可轉化的策略。

使用設備

                                  Micro CT (型號：NEMO) (平生醫療科技)

                                          影像軟件：Avatar（平生醫療科技）