在生物醫學的微觀探索之旅中，我們一直渴望能夠深入了解生物分子在三維空間中的精妙布局。如今，開發了一種結合拉曼染料和組織透明化的多色三維成像技術（RADIANT），實現了在毫米厚度的腦組織切片中一次性成像11種分子組分，把多色成像的深度提升了10到100倍。

研究背景與技術挑戰
生物系統是復雜的三維結構，蛋白質在其中的分布和相互作用對理解生命過程至關重要，比如中樞神經系統存在多種神經元亞型，單個神經元延伸廣泛，研究蛋白質在大體積組織中的分布意義重大。熒光顯微鏡是常用的蛋白質成像技術，但因其熒光光譜過寬，存在“顏色屏障”，一般同時成像目標不超5個。高度多重化蛋白質成像技術雖能增加成像目標數量，卻大多只能用于薄樣本，像循環免疫熒光技術，在厚組織成像時面臨諸多難題，如染色時間長、抗原損失、結構損傷以及圖像配準困難等。拉曼成像雖理論上可突破熒光限制，但靈敏度欠佳。盡管提升了拉曼成像靈敏度，卻受組織光散射影響，成像深度受限。因此，開發能在深層組織中實現高度多重化成像的技術迫在眉睫。

技術創新與應用
拉曼成像的潛力與挑戰
拉曼光譜的振動峰極為狹窄，與熒光光譜相比，分辨率更高。這一特性使得拉曼成像在理論層面具備突破熒光成像“顏色壁壘”的能力，有望實現對多種分子的精準區分與成像。例如，不同分子在拉曼光譜中具有各自獨特的振動峰，如同每個人獨特的“分子指紋”，通過對這些振動峰的識別，能夠準確鑒定不同分子。

當拉曼成像技術應用于生物樣本時，諸多挑戰接踵而至。生物體內分子濃度復雜多樣，拉曼成像的靈敏度相對較低，難以有效檢測低濃度的生物分子。同時，生物組織猶如一道屏障，對拉曼信號存在強烈的散射和吸收作用。這不僅嚴重影響成像質量，還極大地限制了成像深度，使得拉曼成像在深層組織成像方面舉步維艱。盡管科研人員通過優化實驗條件、開發新探針以及結合其他技術提升了其靈敏度，但深層組織成像難題依舊存在，成為阻礙拉曼成像技術廣泛應用的關鍵因素。

RADIANT技術的原理與優勢
為攻克這些難題，RADIANT技術應運而生。該技術巧妙融合拉曼染料和組織透明化技術，成為深層生物組織多色成像的創新解決方案。其核心之一是新型拉曼染料——MARS染料。MARS染料具備在拉曼靜默區成像的獨特能力，有效避開了傳統拉曼染料在指紋區成像時易受組織透明化試劑干擾的問題。同時，它能夠通過免疫標記的方式，精準地與目標生物分子特異性結合，為研究人員定位和檢測目標分子提供了有力工具。

組織透明化技術在RADIANT技術中也起著舉足輕重的作用。傳統組織透明化方法主要服務于熒光顯微鏡，并不完全適用于拉曼成像。研究人員經過系統研究與優化，篩選出適配MARS染料的組織透明化技術，并進一步改進開發出rDISCO技術。rDISCO技術通過降低透明化溫度、添加抗氧化劑等手段，顯著提高了MARS染料成像的信噪比，使得在深層組織中獲取高質量成像成為可能。

與傳統成像技術相比，RADIANT技術優勢明顯。它成功打破“顏色壁壘”，在小鼠小腦薄切片上實現12色成像，極大地豐富了成像信息。其成像深度提升了10-100倍，可對毫米厚度的腦組織切片進行成像，讓科研人員能夠深入探索組織內部的微觀結構。此外，RADIANT技術的免疫標記和成像步驟一次完成，所獲圖像天然具備三維配準效果，無需復雜的配準校正過程，大大提高了成像效率與準確性，為生命科學研究開辟了全新視角，助力科研人員更深入地探索生物微觀世界的奧秘。

成像實驗與結果分析
拉曼染料與組織透明化的兼容性研究
在RADIANT技術研發中，拉曼染料與組織透明化試劑的兼容性至關重要。組織透明化試劑的高濃度化學物質在拉曼光譜指紋區會產生干擾信號。研究人員測試傳統拉曼染料和MARS染料后發現，傳統拉曼染料受干擾嚴重，無法清晰成像；而MARS染料在拉曼靜默區成像，能避免干擾，可穩定標記目標生物分子，為RADIANT技術奠定基礎。

MARS染料的擴展與多色成像
為提升成像能力，研究人員拓展MARS染料，經篩選確定8種性能良好的染料。結合4種熒光染料，利用免疫標記法在小鼠小腦薄切片上實現12色成像。成像時，先處理小鼠小腦組織，再用標記不同染料的抗體染色，通過拉曼和熒光成像技術，可同時觀察多種生物分子分布，像神經元核標記物NeuN、星形膠質細胞標記物GFAP等，展示了小腦組織結構和細胞間關系，體現MARS染料多色成像優勢。

組織透明化方法的篩選與優化
研究人員以MARS染料成像信噪比為標準，對多種組織透明化技術進行篩選。此前基于尿素的技術為保脂質犧牲透明效果，不適用于RADIANT技術。經測試，3DISCO和uDISCO表現突出。深入研究發現，uDISCO因試劑配方能更好保護MARS染料，減少過氧化物對其分解，成像質量更優。基于此，研究人員利用uDISCO實現500微米厚腦組織切片一次性8色三維成像，突破厚樣品“顏色壁壘”，便于深入研究腦組織微觀結構。

rDISCO的開發與性能提升
考慮到MARS染料對過氧化物敏感，研究人員改進uDISCO技術可進一步提升信噪比。rDISCO技術在uDISCO基礎上，其提供的信噪比在整個成像深度范圍內約是uDISCO的2倍。對1毫米厚度腦組織切片成像顯示，rDISCO技術成像更清晰準確，為RADIANT技術廣泛應用提供有力支持。

毫米級組織的一次性多重成像
借助rDISCO技術，研究人員成功實現1毫米厚度腦組織切片一次性11色成像。實驗時，先對切片免疫標記，用rDISCO技術透明化處理，再進行拉曼和熒光成像。這種一次性成像避免傳統循環免疫熒光技術的配準校正難題，保證圖像質量。獲得的11色三維圖像清晰展示腦組織不同細胞類型和生物分子分布，有助于研究人員探究其分布規律和作用機制，為神經系統疾病研究等提供新思路和方法。

多維度信息的提取與分析
RADIANT技術不僅成像出色，還能多維度分析成像數據。在圖像分割上，依據生物分子標記信息可識別不同細胞類型和組織結構；空間相關分析發現星形膠質細胞中波形纖維蛋白和神經膠質纖維酸性蛋白在小腦白質強相關，暗示其協同作用；細胞類型組成分析通過兩種蛋白表達分割出不同分化程度星形膠質細胞，發現其與血管距離分布不同，與星形膠質細胞功能相符；三維距離分析揭示不同分化程度細胞與血管距離差異，反映其功能和發育階段特點；網絡分析計算蛋白中心性，發現β-Ⅲ微管蛋白在小腦浦肯野層中心性高，暗示其對浦肯野細胞的重要性。

總結與展望
RADIANT技術意義非凡。技術上，突破傳統成像局限，實現厚組織多目標超分辨率成像，提高成像深度，為觀察生物分子三維分布及相互作用提供有力工具。生物學研究中，有助于揭示生物發育分子機制，如小腦發育研究。醫學領域，可輔助疾病診斷與病理研究，為腫瘤診療等提供關鍵信息。不過該技術也存在局限。成像深度和染色均勻性依賴樣本，成像速度慢，通量受二抗和探針限制。未來可利用促進運輸技術提升成像深度和染色效果，借助原位信號放大技術提高成像速度，引入新探針并驗證一抗文庫增加成像通量，還可拓展至RNA和DNA成像。隨著技術完善，RADIANT有望在構建組織圖譜、腫瘤研究和腦電路分析等領域發揮更大作用。

論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。
Shi L, Wei M, Miao Y, Qian N, Shi L, Singer RA, Benninger RKP, Min W. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nat Biotechnol. 2022 Mar;40(3):364-373. 

DOI:10.1038/s41587-021-01041-z.