來源：IMMUNO隨筆

共刺激信號域的選擇，組合，拼裝對CAR-T細胞的功能，表型以及持久性都會產生不同的影響，最近一篇發表在Science Advances雜志上的標題為“Dissecting the role of CAR signaling architectures on T cell activation and persistence using pooled screens and single-­ cell sequencing” 的文章利用建庫篩選與單細胞測序技術對CAR信號模塊的搭建做了很細致的研究。

實驗設計流程
CAR信號結構域組合庫的構建：研究者設計了一個包含32種不同CAR變體的組合庫，這些CAR變體基于第一代、第二代和第三代CAR設計，結合了CD28、4-1BB、CD40、CTLA4和IL15RA等五種不同的共刺激信號域，所有CAR變體均使用針對人表皮生長因子受體2（HER2）的單鏈可變片段（scFv）作為抗原結合域。

CRISPR-Cas9基因編輯：通過CRISPR-Cas9技術將CAR基因整合到T細胞的TCRα鏈（TRAC）基因座中，確保所有CAR變體在相同的轉錄調控下表達，并同時敲除TCR，以便在混合樣本中比較不同CAR變體的功能。

體外重復抗原刺激（RAS）實驗：模擬慢性抗原刺激，將CAR T細胞與HER2陽性的SKBR3腫瘤細胞共培養，每3天重新刺激一次，觀察T細胞的效應潛力和持久性。

單細胞CAR測序（scCARseq）：在RAS實驗的不同時間點（第0天、第6天和第12天），對CAR T細胞進行單細胞測序，以解析CAR誘導的T細胞表型，并通過scCARseq確定每個細胞的CAR變體。

實驗結果
CAR T細胞表型的動態變化：通過單細胞測序，研究者觀察到T細胞從記憶狀態到激活狀態，再到效應狀態的動態變化，并在晚期表現出功能障礙和終末分化狀態。CD8 T細胞在RAS過程中比CD4 T細胞更快地失去效應潛力，且CD8細胞數量逐漸減少，而CD4 T細胞比例增加。

CAR變體的持久性評估：在RAS實驗中，CD40信號域在膜近端位置（位置A）的CAR變體顯示出最高的持久性，而CTLA4和4-1BB也在一定程度上促進了T細胞的持久性。

CAR變體的早期激活特性：在與腫瘤細胞共培養6小時后，CD40在位置A的CAR變體能夠快速誘導強烈的效應表型，而4-1BB則傾向于誘導效應記憶表型。

在這項研究中，五種共刺激信號域（CD28、4-1BB、CD40、CTLA4和IL15RA）在CAR結構中的不同位置（膜近端位置A和膜遠端位置B）對T細胞功能的影響被系統地分析。以下是每種共刺激信號域在不同位置的表現總結：

CD28膜近端（位置A）：CD28在膜近端時能夠有效激活T細胞，表現出較強的早期效應功能。然而，CD28在膜近端的CAR變體在長期刺激下表現出較低的持久性，T細胞更容易進入耗竭狀態。CD28膜遠端（位置B）：在膜遠端時，CD28的激活能力相對較弱，對T細胞的長期效應功能影響有限。

4-1BB膜近端（位置A）：4-1BB在膜近端時能夠顯著增強T細胞的效應記憶表型，促進T細胞在長期刺激下的存活。4-1BB膜遠端（位置B）：在膜遠端時，4-1BB對T細胞的效應功能和持久性影響較小。

CD40膜近端（位置A）：CD40在膜近端時表現出最強的激活和持久性增強能力。它能夠快速誘導T細胞進入效應狀態，并在長期刺激下維持較高的細胞毒性功能。CD40膜遠端（位置B）：CD40在膜遠端時仍能促進T細胞的效應功能，但對持久性的影響不如膜近端顯著。

CTLA4膜近端（位置A）：CTLA4在膜近端時對T細胞的激活和效應功能影響有限，甚至可能表現出一定的抑制作用。CTLA4膜遠端（位置B）：CTLA4在膜遠端時表現出較強的細胞毒性效應，尤其是在CD8 T細胞中。這可能與其內化基序有關，促進受體循環和效應功能的維持。

IL15RA膜近端（位置A）：IL15RA在膜近端時對T細胞的激活和效應功能影響有限。IL15RA膜遠端（位置B）：IL15RA在膜遠端時對T細胞的激活和效應功能影響有限，可能更多地起到分子間隔的作用。