酶聯免疫吸附試驗（ELISA）操作技巧匯總
酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是一種基于多孔板的技術，用于確定生物樣品中的抗體、抗原或其他蛋白質的濃度，使用發色、熒光或發光的讀數。自20世紀60年代開發以來，它們已成為許多診斷和生物醫學研究實驗室的主力軍，在一系列應用中表現出特異性、靈敏度和可重復性。常見的例子包括各種傳染病的檢測和妊娠試驗。使用ELISA有很多優點，但必須適當設置和優化，以確保結果可靠。本指南強調確保ELISA實驗成功的技巧。免疫檢測法的精確性表現為單次實驗孔間（批內）的重復性和多次實驗之間（批間）的重復性。CV值高則表明精確度低，通常由以下兩個原因造成：移液技術和洗滌技術。
一、提前規劃
提前規劃可以幫助工作流程有效運行，并減少錯誤和重測的可能性；因此，有必要在工作流程開始前徹底規劃工作流程的所有組成部分。流程圖和檢測設計是重要的規劃考慮因素。需要確定的因素包括：待測樣品的數量、復測次數和所需的試劑平板/試劑盒的數量。
ELISA樣品的復測是很重要的，因為這將突出異常的結果。為提高可靠性，最好使用三份樣本，但必要時也可使用重復樣本。方案中還需要考慮到質控，因為這將表明檢測是否成功，是否保持在動態范圍內，并能進行檢測間的比較和校正。使用流程圖來計劃你的ELISA檢測也將有助于減少任何樣品位置的錯誤。
當使用不同的試劑在多個平板或多個檢測上進行時，所有的平板都需要有明確的標簽和試劑的隔離，以避免混淆。此外，所有的試劑必須徹底解凍（如果需要的話），在使用前進行混合并注明日期，并檢查任何光敏試劑是否變質。
另一個需要考慮的因素，特別是對于夾心法來說，就是一抗和二抗所來自的物種。當使用抗體對時，必須對它們進行測試以找到最理想的信號，并盡量減少任何交叉反應。
許多市面上的試劑盒提供了抗體，然而，如果一個項目涉及到一個新的目標，那么針對已知和未知的樣品測試一系列的抗體是很重要的。在優化檢測時，嘗試不同的抗體稀釋度以提高檢測的靈敏度，同時盡量減少交叉反應和背景噪音。嘗試一系列的樣品稀釋度也可以幫助這個過程。
封閉是工作流程的另一個關鍵部分，它能減少背景信號并將假陽性結果降至最低。一個好的封閉緩沖液將減少非特異性結合，同時不與（或只與最小的）所用的抗原、抗體或檢測試劑發生反應。
封閉緩沖劑通常是蛋白質或非離子型洗滌劑，所用的類型取決于幾個因素，包括所用的抗體、抗原和洗滌劑試劑以及平板的表面化學性質。
最常見的封閉劑類型，牛血清白蛋白（BSA），是一種蛋白質。如果你的背景信號很高，你懷疑封閉不足，使用更高濃度的封閉劑或增加封閉時間可能有幫助。相反，如果你有一個持續的背景問題，可能值得投入時間來優化你所使用的封閉劑類型。
二、樣品處理和移液技術
試劑和樣品處理不當或儲存不正確會影響下游分析，因為不同的緩沖劑和試劑會有不同的儲存要求。例如，有些必須儲存在冰箱里，有些在室溫下，有些用感光罩（如鋁箔）。
如果有計劃在未來的實驗中使用相同的樣品，那么應該把它們放入等分試樣中，需要時再取出來。這將避免多次冷凍/解凍循環，保持準確的結果。當樣品準備使用時，應在冰上解凍（或根據方案）。移液技術注意事項要點如下：
1. 移液時，槍頭應對準孔，避免接觸孔壁及底部。
2. 移液后輕輕晃動混勻試劑。
3. 如果您的樣品具有黏性，請預先潤洗槍頭以消除表面張力的影響。吸液時等待片刻使體積平衡后再取出。
4. 移液不充分或移液體積不均，說明移液器需要校正。必要時請檢查移液器并重新校正。
5. 加樣時，不同的試劑標準品和樣本間都要確保更換槍頭，避免交叉污染。
6. 確保使用合適的槍頭。不合適的槍頭無法正確量取吸液和加樣的體積。
三、確保一致性和準確性
獲得一致和準確結果的方法之一是確保實驗臺被適當地設置，使所有的組件和儀器都觸手可及。使用經過校準的精密移液器也將限制移液過程中的任何不一致。
運行內精密度是指各孔之間的誤差。如前所述，加入重復樣本對識別錯誤和異常情況很重要。變異系數（CV）是一個描述群體內變異性的比率，與觀察值的絕對值無關。當解釋ELISA的數據時，%CV對于識別樣品復制中的任何不一致是很有用的。這表現在測定后的光密度（OD）值之間的變化。總之，%CV越低，結果越精確。
檢測間的精確性是指板間或檢測間的重復性，如在不同的日子完成的檢測。盡管商業化的ELISA試劑盒有測定間質量控制，但科學家們必須保留一個詳細的筆記本，記錄在方案中任何時候的變化，以便其他研究人員能夠以同樣的方式完成同樣的實驗，獲得同樣的結果。這也使得檢測能夠隨著時間的推移進行監測，以確定任何系統性問題或檢測性能的下降。
檢測間的精確性是指板間或檢測間的重復性，如在不同的日子完成的檢測。盡管商業化的ELISA試劑盒有測定間質量控制，但科學家們必須保留一個詳細的筆記本，記錄在方案中任何時候的變化，以便其他研究人員能夠以同樣的方式完成同樣的實驗，獲得同樣的結果。這也使得檢測能夠隨著時間的推移進行監測，以確定任何系統性問題或檢測性能的下降。
四、避免污染
污染會在ELISA數據的下游分析中造成許多問題，如孔與孔之間的高差異、高背景值和弱或低信號強度。有幾種方法可以防止污染：
1.在一個干凈的環境中工作；
2.通過去離子或蒸餾對所有的水進行消毒；
3.每次轉移時使用新的和干凈的試劑；
4.在兩個樣品之間使用新的移液器吸頭；
5.準備和應用樣品時要小心，避免濺到或交叉污染；
6.如果使用自動化，確保系統被清潔，試劑供應經常更新；
7.只去除試劑需要的部分，避免將其倒回庫存瓶中，因為這可能會引入污染物。
五、正確的洗板技術
正確的洗滌和沖洗方案尤其重要。在下游分析過程中，不充分、不一致和/或過度清洗會造成問題。有許多洗板的方法，包括使用自動洗板機、手動分流器或洗瓶。當手動吸出孔中的液體時，要注意不要碰到孔的底部--吸管的尖端應該放在孔的一側。為了減少背景信號，清洗量需要足夠大，以去除孔中未結合的樣品和試劑。然而，過度洗滌會減少目標信號。
確保所有的孔都被平均清洗，以避免在整個檢測板上引入信號變化。要做到這一點，如果是手工清洗，請檢查移液器吸頭是否固定好，如果使用自動洗板機，所有分配和吸液的噴頭必須沒有堵塞。你可以在空板上測試它們，以檢查它們是否同樣工作。
1. 如果使用自動洗板機或多通道移液器，請確保進出口能正常運作。
2. 最后一次洗滌后，翻轉酶標板倒出多余的洗滌液，并在吸水紙上拍干液體。洗板太快或太慢都會降低精確度。不能讓孔內液體自然風干，需立即進行下一步操作。
3. 按照說明書，添加足量的洗滌液至孔內，并保證洗滌完全。
4. 由于洗滌液不是通用的，當試劑盒內的洗滌液用完時，請不要使用其他試劑盒中的洗滌液。如有需要，可聯系技術支持尋求幫助。
5. 不要減少洗滌時的浸泡時間或跳過浸泡的步驟。
6. 按照說明書上的洗滌次數清洗，隨意改變洗滌的次數會影響實驗的精確性。
六、數據歸一化
準確的數據分析是ELISA工作流程中非常重要的一步，它解決了測定間的變異性問題，這可能受到許多因素的影響，如溫度和發育。為了限制這些因素對檢測結果的影響，應在實驗之間通過比較每個板上的標準品來進行歸一化。
七、保持在動態范圍內
至關重要的是，檢測樣品要保持在板式讀數器的動態范圍內，否則結果將不具代表性，儀器的動態范圍可以在機器手冊中找到。在開發檢測方法和確定樣品稀釋度時，最高和最低的陽性樣品都應落在儀器的動態范圍內。標準品通常與ELISA試劑盒一起提供；然而，這些也可以獨立采購。
總的來說，ELISA是許多實驗室的一個重要組成部分。遵循上面的提示將幫助任何人產生準確和可靠的結果。
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