本文要點：含吡啉結構域蛋白3（NLRP3）炎癥小體的靶向NOD樣受體家族小干擾RNA（siRNA）已成為減少缺血性腦卒中后梗死體積和減輕腦損傷的重要治療策略。然而，基于siRNA的療法在臨床轉化中面臨血腦屏障（BBB）的重大阻礙，限制了藥物向中樞神經系統的滲透。為突破這一瓶頸，本文開發了創新型長循環近紅外二區（NIR-II）納米顆粒平臺YWFC NPs，通過精密設計增強BBB轉胞吞作用，實現siNLRP3的高效遞送（siNLRP3@YWFC NPs），并在缺血性腦卒中臨床前模型中驗證其有效性。進一步地，研究者整合先進深度學習神經網絡算法優化腦梗死半暗帶的體內NIR-II成像，在卒中后72小時獲得顯著提升的信背比（SBR）。基于大腦中動脈閉塞（MCAO）小鼠模型的在體研究表明，通過延長NIR-II成像引導的siNLRP3@YWFC NPs圖像導向治療可產生顯著療效優勢。

圖1. 深度學習增強NIR-II成像和圖像引導siRNA (siNLRP3@YWFCNPs）治療缺血性卒中示意圖

本研究開發了靶向NLRP3炎癥小體的siNLRP3@YWFC納米顆粒，其搭載全氟化碳及血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）主動靶向側鏈的超長循環近紅外二區平臺（YW-F13/YW-CC=9:1 重量比），可穿透血腦屏障并精準遞送治療至大腦中動脈閉塞（MCAO）小鼠模型的腦梗死區域。該納米顆粒在體外和體內實驗中均顯示出抑制中樞炎癥、減輕腦組織損傷及改善神經功能的作用。研究首次通過深度學習增強的NIR-II平臺，在治療過程中同步實現腦梗死周圍半暗帶定位與梗死周邊炎癥浸潤程度的精準成像、輪廓勾畫及定量分析。

圖2. YW、YW-F13和YW-CC的合成、光學和物理性能

本文開發了一種新的長循環近紅外二區（NIR-II）納米平臺，由全氟碳YW-F13和VCAM-1主動靶向側鏈的混合物組成（F13 = HO(CH2)2(CF2)5CF3；CC = CVHSPNKKC(Acm)）。這種組合旨在促進BBB的穿越（圖2a）。圖2b顯示，YW的HOMO-LUMO帶隙約為1.75 eV，與NIR-II噻吩并噻唑染料的閾值（通常約為1.6 eV）非常接近。納米平臺高度扭曲的主鏈，間隔基和電子供體之間的扭轉角分別為31.04°和34.53°（圖2c），使得π共軛主鏈可以通過側鏈延伸。這種結構特性是減少分子間相互作用的關鍵，可能增強納米載體在生物系統中的穩定性和功效。免疫熒光和蛋白質印跡實驗進一步證明（圖2d-2e），用促炎細胞因子TNF-α處理細胞6小時后，VCAM-1表達量增加了1.5倍以上（圖2f）。

圖3. 體外攝取和溶酶體逃逸能力siCtrl@YW-F13/YW-CC NPs

優化YW-F13和YW-CC在包載材料中的重量比對于提高納米平臺靶向和遞送至BALB/c小鼠腦微血管內皮細胞（bEnd.3）的效率至關重要。研究結果表明，以YW-F13與YW-CC的9:1比例包載Cy5-siCtrl的Cy5-siCtrl@YWFC納米粒子在bEnd.3細胞中展現出最高的細胞攝取效率，如共聚焦熒光顯微鏡和細胞流式攝取實驗所示（圖3a-c）。合成并確認了能有效與siRNA形成復合物的類脂質材料G0-C14，其重量比為10。如圖3d所示，Cy5-siCtrl@YWFC納米粒子（紅色）的內化主要與晚期內體（綠色）共定位，孵育4小時后表明初始的內吞作用和向晚期內體的運輸。然而，12小時后，大多數納米粒子不再與內體共定位，表明成功逃逸內體并釋放到細胞質中。

YWFC納米粒子和siCtrl@YWFC納米粒子均形成均勻分散的球形膠束，透射電子顯微鏡（TEM）測定的平均直徑分別約為150納米（圖3e）和180納米（圖3f）。YWFC納米粒子和siCtrl@YWFC納米粒子的zeta電位（圖3g）分別為約-2.17毫伏和約-0.98毫伏。YWFC納米粒子和siCtrl@YWFC納米粒子的光致發光激發映射（圖3h-i）顯示最大吸收峰分別在約738納米和740納米處，最大發射峰分別在約1038納米和1048納米處。與ICG相比，YWFC納米粒子和siCtrl@YWFC納米粒子均展現出更好的光穩定性，在持續激發60分鐘的磷酸鹽緩沖液（PBS）中幾乎無衰減（圖3j）。重要的是，在含10%血清的PBS中孵育7天后未觀察到顯著降解，表明這些納米粒子具有相當大的穩定性。

圖4. 缺血性卒中活體NIR-II成像的深度學習

在小鼠短暫大腦中動脈閉塞（tMCAO）后4小時，分別給予YWFC納米粒子和YWF納米粒子（5毫克/毫升，200微升）。通過NIR-II熒光成像從注射后10分鐘至72小時動態可視化缺血性中風（IS）梗死區域（圖4a）。利用基于深度學習的無監督轉換將NIR-II圖像轉換為高分辨率圖像（圖4b）。通過基于知識蒸餾的無監督學習方案，使用不成對的高分辨率（HR）和低分辨率（LR）圖像訓練循環生成對抗網絡，并用于處理NIR-II圖像（圖4c）。在生成器之間進行不同域之間的轉換后，判別器DL和DH用于區分生成的圖像和真實圖像。用于圖像翻譯和分割的學生網絡采用U-Net結構，在有限的訓練數據下提供高性能。對于低分辨率圖像輸入，SGLH/SGHL和TGLH/TGHL模型均生成圖像，教師模型和學生模型之間的差異用于指導學生的學習過程。如圖4d所示，NIR-II圖像首先轉換為四通道圖像，然后輸入蒸餾模型進行分割。SSeg和TSeg模型同時分割同一圖像，差異指導學生的學習。

基于深度學習的方法通過將次優的低分辨率圖像轉換為清晰的高分辨率圖像來增強NIR-II成像，如NIR-IIb成像所示。此外，深度學習方法能夠生成定量指標，用于通過血管分割對血管密度進行比較分析。如圖4e所示，在MCAO小鼠中，靜脈注射YWF納米粒子和YWFC納米粒子后10分鐘，梗死區域的熒光信號明顯低于對側非梗死區域，從而能夠在分鐘級別識別缺血性中風（圖4f）。深度學習模型被用于分析梗死和對側非梗死腦區域的血管結構，能夠有效區分炎癥浸潤，具有高度統計學顯著性（P < 0.0001，圖4f）。相比之下，未注射NIR-II納米材料的PBS組在成像儀下未顯示任何圖像。此外，在MCAO小鼠中，靜脈注射YWFC納米粒子后，病變部位（半暗帶區域）的NIR-II熒光信號從6小時到72小時逐漸增加，并在72小時達到峰值。在72小時，重建的NIR-IIb熒光成像的信背比（SBR）為6.00，比原始NIR-II熒光成像的SBR 3.30增加了1.85倍，或改善了85.1%。相比之下，由于缺乏靶向肽，YWF納米粒子在病變部位的富集較少（圖4g）。有趣的是，在梗死半暗帶區域，NIR-II熒光富集的顯著差異持續了長達3天，這可能是由于YWFC納米粒子在病變部位的長時間循環（圖4h）。

圖5. siNLRP3@YWFC NPs壓制NLRP3并抑制了體外下游相關炎癥蛋白的表達

siNLRP3–1770在RT-qPCR和Western blotting實驗中顯示出最高的干擾NLRP3表達的效率，作為為后續研究的對象。在75 nM濃度下，經過72小時后，siNLRP3@YWFC納米粒子對NLRP3的敲低效率在RNA和蛋白質水平上均超過60%，而未處理的細胞作為對照組（圖5a-5c）。

此外，開發了一種氧糖剝奪/再氧合（OGD/R）模型來模擬體外的缺血再灌注。該模型用于評估siNLRP3@YWFC納米粒子對腦缺血再灌注損傷（CIRI）的神經保護作用（圖5d-5f）。將OGD/R處理的BV2細胞作為4小時的陽性對照，并收集細胞蛋白進行Western blot分析。靶向處理組siCtrl@YWFC納米粒子作為對照，而非靶向處理組siNLRP3@YWF納米粒子和靶向處理組siNLRP3@YWFC納米粒子作為處理組。如圖5g-5h所示，OGD/R陽性對照顯著上調了NLRP3炎性體的表達。非靶向siNLRP3@YWF納米粒子和靶向siNLRP3@YWFC納米粒子分別有效敲低了NLRP3表達71.7±7.6%和83±3.2%，并抑制了下游蛋白IL-18（45.2±4.2%, 50.7±6.1%）、IL-1β（43.4±10.7%, 54.4±9%）、裂解的caspase-1（32±8.8%, 40.8±8.7%）和ASC（42.3±15.7%, 54.2±9.4%）的表達。靶向處理組對NLRP3炎性蛋白的抑制最為顯著，強烈表明siNLRP3@YWFC納米粒子通過敲低NLRP3炎性體減輕了炎癥反應。

圖6. NIR-II圖像引導治療siNLRP3@YWFCMCAO模型小鼠的NPs

為了進一步評估siNLRP3@YWFC納米粒子在體內的治療效果，將MCAO模型小鼠隨機分為5組（每組5只小鼠）。小鼠在14天內每3天通過靜脈注射接受一次PBS、siCtrl@YWFC納米粒子、siNLRP3@YWF納米粒子或siNLRP3@YWFC納米粒子，siRNA劑量為6毫克/千克（圖6a）。在3-14天的治療周期內，siNLRP3@YWFC納米粒子和siCtrl@YWFC納米粒子組的梗死病變中的NIR-II熒光信號高于其他組的梗死和對側非梗死區域（紅色圈出）。然而，在治療期間，siNLRP3@YWF納米粒子組的雙側腦區熒光信號未見顯著差異（圖6b）。差異比率定義為梗死區與非梗死區NIR-II平均熒光強度差與總強度的比值，這是通過深度學習得出的定量指標。較高的差異比率表明炎癥程度較高。如圖6c所示，在藥物注射后的前1-3天內，siNLRP3@YWFC納米粒子和siCtrl@YWFC納米粒子的差異比率均保持在約0.25-0.31，表明兩組在腦梗死區的炎癥水平無顯著差異。有趣的是，在隨后的4-14天內，siCtrl@YWFC納米粒子組的差異比率顯著快于siNLRP3@YWFC納米粒子組，到第14天達到0.37±0.05。這表明梗死區的炎癥程度較高，而siNLRP3@YWFC納米粒子組的差異比率為0.19±0.08。這一量化結果證實，14天的siNLRP3@YWFC納米粒子治療有效抑制了炎癥。各組大腦的明場和NIR-II熒光圖像如圖6d所示。在大腦表面熒光富集區域，siNLRP3@YWFC納米粒子的信號低于siCtrl@YWFC納米粒子，而siNLRP3@YWF納米粒子在14天時梗死側幾乎無熒光信號。siNLRP3@YWF納米粒子對NLRP3的長期抑制可能有助于觀察到的炎癥減少。通過7.0T小動物MRI評估了MCAO后3天和14天MCAO小鼠大腦的區域變化（圖6e）。經過14天的治療，siNLRP3@YWFC納米粒子的混合T2信號顯著低于PBS、siCtrl@YWFC納米粒子和siNLRP3@YWF納米粒子組，在梗死側觀察到的腦萎縮最小（圖6f）。這些結果表明，siNLRP3@YWFC納米粒子可以有效減少MCAO小鼠的腦梗死面積并限制腦萎縮。

圖7. siNLRP3@YWFC減少小膠質細胞的募集，降低炎癥相關因子的表達，改善中風后神經元損傷，減少腦萎縮體積

如圖7a所示，siNLRP3@YWFC納米粒子組在缺血皮質半暗帶中顯示出最低的NLRP3熒光表達，同時炎癥標志物（如小膠質細胞標志物IBA1）減少，NeuN+神經元數量增加。與PBS、siCtrl@YWFC納米粒子和siNLRP3@YWF納米粒子組相比，siNLRP3@YWFC納米粒子組顯示出IBA1+細胞數量減少（圖7b）、NeuN+神經元數量增加（圖7c）、NLRP3熒光表達降低以及NLRP3的長期沉默，從而抑制了中樞炎癥并部分恢復了神經元表達。通過蘇木精-伊紅（H&E）和甲基紫染色（圖7d）比較了假手術組與PBS、siCtrl@YWFC納米粒子、siNLRP3@YWF納米粒子和siNLRP3@YWFC納米粒子組。siNLRP3@YWFC納米粒子治療顯著減少了梗死體積，而其他組在第14天未觀察到腦梗死的顯著變化（圖7e）。表明siNLRP3@YWFC納米粒子治療有效減輕了腦萎縮。

治療后第14天，處死模型小鼠并提取腦組織蛋白進行分析。圖7f的結果表明，siNLRP3@YWFC納米粒子組顯著下調了NLRP3蛋白水平，降低了59.6±9.8%。此外，與siCtrl@YWFC納米粒子組相比，siNLRP3@YWFC納米粒子組炎癥相關因子的蛋白表達水平降低：IL-18降低19.8±2.3%，IL-1β降低63.7±10.0%，裂解的caspase-1降低49.7±13.7%，ASC降低50.3±15.5%（圖7g）。總體而言，數據表明siNLRP3@YWFC納米粒子可以長期沉默NLRP3炎性體，抑制炎癥反應，并在一定程度上保護腦神經元，從而減少腦萎縮，凸顯了靶向疾病治療的重要性。

參考文獻

Yu K, Fu L, Chao Y, et al. Deep Learning Enhanced Near Infrared-II Imaging and Image-Guided Small Interfering Ribonucleic Acid Therapy of Ischemic Stroke[J]. ACS nano, 2025，19, 10, 10323–10336.

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