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美國Fluidigm公司Bio-Mark™基因分析系統介紹

瀏覽次數：18784　發布日期：2009-6-2　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

美國Fluidigm公司Bio-Mark™基因分析系統介紹

美國Fluidigm公司www.fluidigm.com創立于1999年，總部設在美國加州。其創始人是Steve Quake和Gajus Worthington(公司CEO)。Steve Quake是美國斯坦福大學教授，是微液流領域（Microfluidic Technology）的權威專家http://thebigone.stanford.edu/。Fluidigm公司有兩個產品線，蛋白結晶微芯片Topez和超高通量基因分析系統Bio-Mark™。其Topez的應用得到了象伊波拉病毒這樣的蛋白結晶（《Nature》2008年7月份封面圖片）。而其Bio-Mark™超高通量基因分析系統更是開創了超高靈敏度、超高通量基因分析的全新技術平臺，得到了全世界超過100家重點生命科學研究機構（Stanford University,Myriad Genetics,GHC Technology）、制藥公司(Merck Rosetta, AstraZeneca)及政府部門(Fred Hutchinson Cancer Research Center,NCI)等的廣泛認可和應用。

Bio-Mark™基因分析系統是集成流體通路（Integrated Fluidic Circuit，IFC）技術、實時定量PCR技術及強大的基因分析軟件相結合的技術平臺。其創新技術就在于集成液體通路技術：利用集成電路制作工藝（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，通過不同的控制閥門控制溶液在其中的流動來實現生物樣品的分液、混合、PCR擴增。集成流體通路技術極大地簡化了生物樣品和試劑的分液操作，提高分析通量和靈敏度，其納升級的反應體系為高通量的基因分析應用節省大量成本（試劑用量更少，樣品量更少）。

Bio-Mark™基因分析系統由Bio-Mark™實時PCR系統（整合了高性能計算機）、IFC微液流芯片（耗材）、IFC Controller（將生物樣品、反應試劑導入到IFC微液流芯片中）和數據分析軟件四部分構成。IFC微液流芯片有2種：Dynamic Array（48.48動態芯片和96.96動態芯片）和Digital Array（12.765數碼芯片和48.770數碼芯片），應用于不同的基因分析中：拷貝數變化分析、遺傳突變檢測、基因分型、基因定量、單細胞基因表達等。

Bio-Mark™系統

從下面的具體應用及跟傳統基因分析方法的比較上，我們可以很直觀地看到Bio-Mark™基因分析系統在通量、靈敏度、靈活度上的革命性的突破。

1.BioMark™ Digital Array數碼芯片 :

· 樣本與試劑只需鈉升級 (nL) 比傳統方法少1,000倍, 大幅減少試劑用量

· 通過IFC部件, 樣本濃縮1000倍, 敏感度大大提高，檢測更準確，能檢測到單拷貝, 高重復性

· 使用傳統試劑, 操作簡單快捷, 省去再開發時間

· 應用廣泛, 如樣本定量 (Slingshot), CNV, SNP, Genotype, Haplotype, 遺傳病/突變檢測等

（1）Bio-Mark Slingshot 系統 : 第二代測序儀樣本濃度確定

——無需參照樣本, 絕對定量, 高效替Roche GS 454、ABI SOLiD和Illumina Solexa等第二代測序平臺上機前作樣品濃度準確定量，可大大減少試劑用量！

（2）拷貝數變化 / 遺傳病 / 突變檢測

拷貝數變化（Copy Number Variation, CNV）廣泛用于藥物代謝、癌癥、免疫相關疾病、人類基因組變異以及由基因變異引起的相關疾病的研究。

Bio-Mark^TM Digital Array

采用 12.765陣列PCR反應芯片，通過數字PCR，每個反應體系用量僅6 nL, 可有效分辨12與13倍（或更高）的差異。

采用常規PCR 方法和試劑, 無需改變工作流程, 結果一目了然, 方便比較

最多能兼容4種熒光染料，進行多通道PCR

傳統分析方法（SNP微陣列分析或比較性基因組雜交(CGH)）：

· 敏感性和分辨率較低，缺乏客觀標準，不能準確量化結果

· 操作煩瑣, 需要大量本試劑，假陽性非常高

常規qPCR技術:

· 最多只能分辨2與3倍的DNA拷貝數差異，試劑價錢昂貴。

2.Bio-Mark™ Dynamic Array 動態芯片：

· 高通量，最高每次可處理9216個qPCR反應（96樣本× 96基因）

· 采用常規試劑方法, 用量為傳統1% （反應為nL級）

· 無需繁瑣加樣, IFC全自動進樣混合,減少人為誤差

· 利用IFC技術自動操作，重復性好

· 樣品、反應液組合自由多樣，應用廣泛，用戶彈性大

（1）基因表達

· 樣本量為nl 級, 能有效進行單細胞基因表達研究

· 適合干細胞/ 癌細胞研究

在2009年5月7日的美國Nature主頁文章《A closer look at the single cell》中詳細介紹了Fluidigm Dynamic Array在單細胞表達中的應用。詳細內容請看鏈接
http://www.nature.com/stemcells/2009/0905/090507/full/stemcells.2009.71.html

（2）基因分型

——通過簡單加樣，Bio-Mark™ 基因分析系統能在短時間內分析成千上萬個基因（96×96 / 48×48）：

· 少試劑用量、低成本

· 使用常規方法但更高通量

· 高檢出率（Call Rate），>99.5%

· 快速高效，可日處理7萬個基因型

對9000個SNP數據點進行分析時時，使用384微孔板與96.96 Dynamic Array的對比結果：

	384微孔板	96.96動態陣列
Master Mix	46,000µL	240µl
Primer-probe	9,200µL	480µl
總移液次數	18,432	192
Plates	24	1

近年來SNP的研究是一個熱門課題，可用于SNP研究的方法和設備也層出不窮，而Fluidigm的BioMark Dynamic Array的出現是對SNP研究方法的一個非常重要的補充。我們通過對比一下幾種市場上SNP中通量分析的主要設備來看看BioMark Dynamic Array有哪些優勢。

指標	BioMark™	MassARRAY	OpenArray	SNPstream
生產商	Fluidigm	Sequenom	ABI	BeckmanCoulter
通量(SNPs/day)	70,000	100,000	200,000	4600~300,000
Maximum Multiplex level	96	384	3,000	48
Assay conversion rate	99%	80-90%	95%	80-85%
檢出率 (call rate)*	99.5％	90-95%	99%	98.8％
準確率	>99.8%	>99.7%	>99.7	>99%
靈敏度（樣本上樣量）	2.5ng DNA	10ng DNA	125ng DNA	2ng DNA
一個分析流程時間	3小時	570分鐘	~8小時	1－2天
技術	Real-time PCR	時間飛行質譜	End-point PCR	雜交方法
Cost per data point	~$0.06	~$0.03	~$0.10	~$0.10

*檢出率（Call Rate）：對于SNP研究而言，檢出率（Call Rate）是一個相當重要的指標，例如在一個樣本上同時檢測48個SNP位點，檢測率為98.8%的方法，其檢測的成功率是：98.8×98.8×98.8×…98.8=0.560=56%，而檢出率是99.5％的方法，其檢測的成功率則是：99.5×99.5×99.5×…×99.5=0.786=78.6％，可以看出檢出率對檢測的成功率的影響是顯而易見的，同時檢測的SNP位點數越多，影響越大。

盡管在通量上Fluidigm的BioMark Dynamic Array并不理想，但采用實時PCR分析方法，突出的指標特別是超高的檢出率和簡單、快速的分析流程，使得其在中通量SNP分析方法中具有相當的競爭力。

綜合評定Bio-Mark™基因分析系統，

· IFC整合系統，簡化傳統熒光定量PCR操作步驟，使操作流程簡化至1/48（48.48動態芯片）或1/96（96.96動態芯片）。

· 與ABI 7900 熒光定量數據具有很好的統一性。

· 重復性好，批內批間相關系數極高，p=00.0000。

· 超高通量，Dynamic Array最多可實現9216個樣本的同時檢測，Digital Array一張芯片上最多可同時進行10,000(12.765數碼芯片)或37,000（48.770數碼芯片）個反應。

· nl級反應體系，比傳統試劑耗費減少100倍，成本消耗節省一倍以上。

· 人性化數據分析軟件，使您更加靈活的得到可靠數據。

在實際的科研應用中，越來越多的報導顯示了Bio-Mark™基因分析系統正迅速地被科研工作者應用到實際研究中，

· 中國學者使用BioMark超高通量遺傳分析系統發表高質量文章

· NCI使用BioMark基因工程系統開展研究遺傳與基因組

· 劍橋大學采用Fluidigm公司的EP1系統進行癌癥和疾病的研究