GS FLX系統是由羅氏454生命科學公司推出的目前應用最廣的超高通量基因組測序系統，研究人員利用高準確性、長讀長的GS FLX系統快速的獲得高質量的生物數據，取得科研突破性進展。自GS系統問世以來，于世界頂級雜志共發表250余篇高質量的文獻，使GS FLX系統成為發表論文速度最快的高通量測序儀器。

 

GS FLX測序系統依靠生物發光進行DNA序列分析，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的協同作用下，將每一個dNTP的聚合與一次化學發光信號的釋放偶聯起來，通過檢測化學發光信號的有無和強度來達到實時測定DNA序列的目的（）。此技術不需要熒光標記的引物或核酸探針，也不需要進行電泳，具有分析結果快速、準確、高靈敏度和高度自動化等特點。每次測序反應只需10小時即可完成5億個堿基數據，平均測序讀長可達400到500個堿基，讀長超過400bp時，測序準確性大于99.99％。

 

利用GS FLX系統的高度靈活性可以在眾多領域進行開創性科學研究，進而為生物科學、醫學研究開拓更多新的研究方向。

 

對于未知基因組如野生菌群，由于沒有reference可以比對，其它測序儀（平均讀長35bp）很難準確測得其序列，而GS FLX系統由于具備了一個反應500Mb的通量和長達450bp的單一讀長能力，使其可以輕易的在一個反應里完成從細菌到病毒的未知基因組的全基因鳥槍法測序。標準的未知基因組拼接使用GS FLX de novo Assembler 軟件把讀長序列拼接成contigs。通過應用配對末端（Paired End）技術，可以對測序產生的contigs進行排序并決定它們的相對位置,從而獲得高質量、完整的拼裝。GS FLX是目前得到Gap最少、后續Finishing費用最低的測序系統。

細菌基因組中有很多重復序列，用Paired End 測序技術可跳過3Kb重復序列。明年初454公司將推出20Kb Paired End 測序技術，這樣所有基因組中的最長的重復序列都能跳過，細菌基因組拼接可一次完成。

 

    微生物基因組：GS FLX最早應用于細菌的全基因組測序，其特點是測序速度非常快。Johnson & Johnson藥物研發中心曾利用454測序技術檢測樣本中被藥物抑制的基因。通過增加藥物劑量篩選抗藥菌株，能夠存活下來的菌株因突變而帶有抗藥性，突變位點即可能是藥物靶點。由于細菌突變位點通常比較多，所以選取兩個抗藥菌進行測序，并跟原始的非抗藥菌做比對。測得的幾千萬個堿基數據顯示，抗藥菌的四個位點有突變，沒有帶抗藥性的菌株無突變。進一步研究發現其中一個酶是藥物靶點。此實驗使用GS FLX僅一個星期即可測完一個細菌，得到實驗結果。

 

    大型動物、植物全基因組：454公司曾與澳大利亞、新西蘭實驗室合作，用測序方法篩選羊基因組的genetic marker，測序覆蓋率0.5倍，共測得1.5G數據。然后用牛的基因組草圖進行拼接比對，即可獲得genetic polymorphism。應用此方法可迅速的篩選幾千萬個marker。此外，結合Sanger和454，已經測出葡萄的序列。桔子、高梁、玉米等植物也在使用454進行基因組測序。

 

    人體基因組結構和突變：使用長讀長和Paired End技術來探測大規模的基因組變動，能獲得更大的基因組覆蓋率，鑒定更多的基因變異，如基因片斷的插入、缺失或拷貝數變異，相比短讀長技術可多獲得25％以上的信息。454公司跟耶魯大學某實驗室合作，用人的基因組做Paired End 文庫，將文庫大小調整至約3Kb，并對兩端進行測序。發現所得數據與基因組數據相差6Kb，以此可推測樣品有3Kb的片斷缺失。

 

    GX FLX的擴增子測序靈敏度高，可鑒定低頻率突變和單倍體，如外顯子或病毒準種，可檢測到低于0.5％的變異。例如基于擴增子超精細（ultra-deep）測序方法，可在混合的腫瘤樣品中識別稀少的體細胞突變，或者在微生物、人類、動物或者植物群體中分析遺傳差異，揭示SNP位點。

 

    GS憑借能夠以前所未有的敏感性和速度從混合樣本中快速準確的鑒定突變，被應用在HIV抗藥性變化的研究中。由于HIV反轉錄酶的誤差量很高，HIV在人體內突變速度非常快，而且會使藥物靶點也發生突變，從而使藥物失效。某制藥公司用GS FLX對病人血液中的HIV進行測序，通過將測序結果與Stanford 大學建立的突變與藥物失效關聯性的數據庫進行比較，判別HIV是否出現抗藥性，如果出現則立即換藥。

 

較之短讀長技術，GS FLX可更精準的預測物種在不同環境下的差異性。如麻省理工某海洋生物研究所采集火山口附近的生物樣品，對海底生物進行研究。通過對細菌樣本測序，發現海底生存的細菌與陸地細菌菌種不同，不同海域的細菌也有完全不同的細菌組成，而且幾年后的演化也有不同。

 

    GS FLX為快速鑒定新的疾病病源提供了高效精準的檢測工具。2008年三位澳大利亞病人接受了肝臟移植手術，捐獻者為五十七歲男子，死于腦溢血。但是手術四至五周后，三名受捐者因患類似疾病而陸續死亡。哥倫比亞大學研究人員預計有未知病毒在肝臟移植時沒能通過常規方法檢測到，于是使用GS FLX對所有cDNA進行測序。測得的十萬余序列結果顯示，其中十四個序列確實與淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒相似，通過PCR方法也驗證了此病毒亦出現在受捐者器官內。

 

    受此研究啟發，腫瘤研究人員利用454測序驗證病毒與腫瘤的發作是否有直接作用關系。通過檢測皮膚瘤cDNA，發現多處腫瘤的T antigen與人體 receptor tyrosine phosphatase

形成融合蛋白。于是研究人員設想病毒可能通過此結合方式抑制相關蛋白，進而可能導致腫瘤的發育。通過檢測更多不同的腫瘤細胞，發現不同的腫瘤細胞均有同樣的融合蛋白，從而驗證了病毒會導致腫瘤的發育，病毒產生抗藥性機制跟腫瘤相似，均是通過突變的方法。

 

    啟動子區域CpG島的低甲基化和高度甲基化是許多基因進行活性調節的重要機制之一。通過亞硫酸鹽處理，GS FLX可以對指定的目的基因組序列內每個CpG島甲基化狀態進行檢測，并對每一個甲基化進行定量分析。如對結直腸癌的樣本和它們臨近的正常組織進行分析，用亞硫酸鹽對樣本啟動子進行處理，如無C到T的轉化意味該位點沒有甲基化，反之則該位點發生了甲基化。每個腫瘤可繪一圖譜，通過圖譜間的比較，可發現有些基因在不同的腫瘤有不同的profile，進而啟發新的科研預測。

 

    較之短讀長技術，長讀長技術可發現更多的基因注釋，更準確的預測假基因，并獲得可靠的等位特異表達譜，可以更靈敏的檢測基因表達的高低，更好的拼接基因模型。有些Sanger很難測到的表達量非常低的基因序列，454都可檢測到。

 

隨著高通量測序技術的不斷發展，使用常規PCR方法進行大量重測序樣品準備費用高、耗時長。針對此問題，羅氏NimbleGen(www.nimblegen.com)成功開發了目標序列捕獲芯片（Sequence Capture Array）技術，可在一張芯片上富集長達 5Mb的任意目標基因組區域，如外顯子、疾病相關區域、啟動子、增強子等。相對PCR方法，此技術可大大降低樣品準備的時間及費用。今年底，NimbleGen將推出2.1M芯片，可同時富集30Mb的目標序列。NimbleGen序列捕獲技術與GS FLX高通量測序儀的完美結合致力于以最低的價格、最好的性能實現特定應用領域的研究，帶給生物醫學研究飛躍性突破。